IS 6110:
A técnica de tipagem molecular utilizando a análise do poliformorfismo
no tamanho do fragmento de restrição - Restriction Fragment Lenght Polymorphism (RFLP) é correntemente empregada para identificação das diferentes cepas de Mycobacterium tuberculosis (Van Embden et al., 1993). Neste estudo utilizou-se como sequência alvo para diferenciação das cepas em cultura, o elemento repetitivo IS6110 que se encontra presente exclusivamente no complexo Mycobacterium tuberculosis. Os testes foram gentilmente realizados e analisados pela Dra Fátima Cristina Onofre Fandinho Montes no Instituto Osvaldo Cruz da Fiocruz – RJ.
A partir da cultura em meio Lowenstein-Jensen aproximadamente uma alça repleta de crescimento bacteriano foi transferido para um tubo de Eppendorf contendo 500µL de tampão TE 1X (Tris –HCl 10 mM, pH 7.5, EDTA 1 mM, pH 8.0). As amostras foram aquecidas em banho-maria a 80°C por 20 minutos para inativação das micobactérias. A lise bacteriana ocorreu pela adição de 50µL de lisozima (Sigma Chemical CO, USA) e a mistura foi agitada em homogeneizador automático e em seguida incubada a 37°C por 18 horas. Após este período, foram acrescidos 60µL de proteinase K (Sigma Chemical Co, USA) a 10 mg/mL e 70µL de SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) a 10% (v/v) ( Sigma, USA), sendo a mistura então incubada em banho-maria a 65°C por 10 minutos. Foram adicionados 100µL de solução de NaCl 5M e 80µL de CTAB (Hexadecyl Trimethyl-ammonium Bromide, Sigma, USA) a 10% (p/v), seguido de incubação por 10 minutos em banho-maria a 65°C.
Em seguida, volumes iguais de clorofórmio (350µL) (Merck) e álcool isoamílico (350 µL) (Merck) foram adicionados e os tubos agitados em homogeneizador automático e centrifugados por 5 minutos a 12.000g. A fase superior aquosa foi transferida para novos tubos e adicionados de 450µL de isopropanol gelado (Merck). Os tubos foram mantidos durante a noite a -20°C. Após este período, os tubos foram centrifugados a 12.000g por 20 minutos e o sedimento lavado com 250µL de etanol gelado (Merck) a 70%. Após evaporação do etanol, foi adicionado ao sedimento 50µL de tampão TE 1X e estocado em freezer a –20°C até o momento do uso.
A digestão das amostras de DNA isoladas foi efetuada pela endonuclease PvuII. Esta enzima cliva o DNA no sítio GAG/CTG e cada seqüência IS6110 apresenta apenas um sítio de restrição para esta enzima. A mistura de reação foi preparada adicionando-se: uma alíquota correspondendo a 5µg de DNA, extraído pelo método acima descrito; 1µL da enzima PvuII (10U/µL) (GIBCO/BRL, USA); 3µL de tampão React 6 (10X concentrado) (GIBCO/BRL,USA) e volume de água necessário para completar um volume final de 30µL de água destilada estéril. A mistura de reação foi incubada em banho- maria a 37°C por um período de 18 horas.
Para separação dos fragmentos obtidos pela restrição com PvuII das amostras de DNA foi efetuada a eletroforese em gel de agarose 0.8% em tampão TBE 1X por 18 horas a 25V. Ao final da eletroforese, os fragmentos de DNA separados na matriz de agarose foram depurinados através de tratamento com 0,25M HCl por 10 minutos, sendo em seguida desnaturados com 0,4M NaOH por 20 minutos. Os fragmentos de DNA foram transferidos para membrana de nylon (Hybond – N+, Amershan Pharmacia Biotech) a vácuo (Vaccum Blotter apparatus – Amershan – Pharmacia Biotech), utilizando-se como solução de transferência o próprio NaOH 0,4 M. A enzima PvuII utilizada para a digestão do DNA neste estudo, cliva em apenas um sítio dos 1345 pb do IS6110. Foi preparada uma sonda através do método de amplificação por PCR de um fragmento de DNA situado no elemento IS6110 à direita do sítio de restrição da enzima PvuII no mapa físico deste elemento de inserção. Para este fim, foi utilizado o DNA da cepa padrão de Mycobacterium tuberculosis (Mt
14323) e os oligonucleotídios iniciadores utilizados foram: INS1 :5’ CGT-GAG- GGC-ATC-GAG-GTG-GC e INS2 :5’ GCG-TAG-GCG-TCG-GTG-ACA-AA
A amplificação foi efetuada em termociclador automático (PTC-100 –
Gibco) utilizando um programa que consistia de: desnaturação inicial do DNA a 95°C por 10 minutos, e 30 ciclos de desnaturação a 94°C por um minuto, anelamento a 56°C por 2 minutos e extensão a 72°C por um minuto.
Após a amplificação, o produto do PCR foi submetido a uma precipitação com 0.1 volume de Acetato de Sódio 3M, seguida da adição de 2 volumes de etanol 100% gelado. A mistura foi homogeneizada e em seguida incubada a -20°C durante a noite. Posteriormente, foi efetuada centrifugação a 12.000g por 20 minutos a 4°C, e o sedimento lavado com etanol a 75% (v/v) gelado. Após evaporação de etanol residual, o sedimento foi ressuspenso em 500µL de tampão TE 1X, sendo aliquotado e armazenado a -20°C antes da marcação.
O fragmento de DNA amplificado que contêm a IS6110 foi diluído com água Kit ECL (Amershan – Pharmacia) a uma concentração de 10 ng/ml. Em seguida, foi desnaturada em banho-maria a 100°C por 10 minutos, e após este período foi imediatamente resfriada em gelo por 5 minutos. Posteriormente foram adicionados os reagentes do Kit ECL DNA labeling reagent e glutaraldeído. A solução foi centrifugada a 12.000 g e incubada por 10 minutos a 37 °C, sendo a seguir utilizada na hibridização da membrana.
A membrana de nylon contendo os fragmentos de DNA fixados foi lavada com solução de pré-lavagem SSC 2X (20X SSC = NaCl 3 M, Na-citrato 0,3 M, pH 7.0) a temperatura ambiente até o momento da hibridização. A membrana foi então colocada em garrafa de hibridização, na qual foi adicionado o tampão de hibridização do Kit ECL e então incubada em forno com rotor giratório (Robbins) a 42 °C por 1 hora para execução da etapa de pré- hibridização. Após este periódo, a sonda marcada foi adicionada e a hibridização ocorreu durante 18 horas. No dia seguinte, mantendo a temperatura de 42°C, a membrana foi submetida a duas lavagens com 20 mL de tampão de lavagem (uréia 0,36 mg, SDS 0,004 mg, SSC 20X) por 20 minutos. Em seguida a membrana foi retirada do forno e submetida a duas lavagens com tampão SSC 2X por 5 minutos à temperatura ambiente.
A membrana foi levada para uma câmara escura para ser realizada a auto-radiografia. Em um tubo, foram misturados volumes iguais do reagente de detecção 1 (peroxidase) e reagente de detecção 2 (luminol). A membrana foi tratada com esta mistura por 1 minuto à temperatura ambiente e em seguida foi colocada em contato com o Hiperfilme ECL (Amershan Pharmacia) por um período de 2 horas. Através de análise visual, as cepas que apresentaram perfis idênticos foram classificadas em “clusters”.