Hormon analizleri

3.2.5.1. Ekstraksiyon ve saflaştırma

Örneklerde jasmonik asit (JA) ekstraksiyon ve saflaştırma işlemleri bazı değişikliklerle Topçuoğlu ve Ünyayar (1995)’a, HPLC analiz işlemleri ise Gundlach vd (1992)’e göre modifiye edilerek yapılmıştır. Ekstraksiyon ve temizleme işlemleri ışıktan bozulmayı engellemek amacıyla, çok az ışığın olduğu bir ortamda aşağıdaki sıraya göre yürütülmüştür. Yaprak örneklerinde jasmonik asit ekstraksiyonu Şekil 3.1’de gösterildiği gibi uygulanmıştır.

I) 2 g taze ağırlıkta kıyılmış yaprak örnekleri, içlerinde 40 ml ekstraksiyon solventi (metanol:kloroform 12:5 v/v) bulunan 200 ml’lik kapaklı kavanozlara konulmuş ve ultraturrax ile homojenize edilmiştir. İçinde ekstraksiyon solventi bulunan bu kavanozlar, derin dondurucuda -18 °C’de 2 hafta süreyle dinlendirilmiştir. 2 haftanın sonunda örnekler whatman-42 filtre kağıdından süzülerek posa ve sıvı faz birbirinden ayrılmıştır. Daha sonra posanın içinde de bir miktar sıvı faz kalabileceği düşünülerek, posanın üzerine 20 ml ekstraksiyon solventi eklenerek -18 °C’de 1 hafta daha dinlendirilmiştir. Bu 1 haftanın sonunda tekrar aynı şekilde süzme işlemi yapılmış ve sıvı fazlar birleştirilerek posa atılmıştır.

II) Her bir kavanozdaki ekstrakt, 250 ml’lik ayırma hunilerine alınmış ve üzerine 20 ml distile su ve 20 ml kloroform konulmuştur. Büyüme hormonları hariç sulu metanol fazındaki organik maddelerin kloroform fazına geçmesi sağlanmıştır. Daha sonra, dinlenme sırasında kloroform ve sulu metanol fazları birbirinden net olarak ayrılmıştır. Ayırma hunilerindeki musluklar yardımıyla altta kalan kloroform fazı atılmıştır. Kloroform fazının tamamıyla atılabilmesi için ayırma hunilerinde kalan sulu metanol fazı evaporasyon balonlarına alınarak su fazı kalana kadar rotary-evaporatörde 45 °C’de su banyosu içinde ve vakum altında buharlaştırılmıştır.

III) Evaporasyon balonlarında kalan su fazının pH’sı 1 N HCl kullanılarak, 2.5’ e ayarlanmıştır.

36

IV) pH’sı 2.5’e ayarlanan ve 250 ml’lik ayırma hunilerine alınan her bir örnek üzerine 15 ml etil asetat konulmuştur. Bu ayırma hunileri kuvvetli olarak 3-4 kez çalkalanmış ve etil asetat ile su fazındaki JA’in etil asetat fazına geçmesi sağlanmıştır. Daha sonra, dinlenme sırasında etil asetat ve su fazları birbirinden net olarak ayrılmıştır. Ayırma hunisindeki musluk yardımıyla, altta kalan su fazı bir behere, üsteki etil asetat fazı ise daha önceden hazırlanan etiketli kavanozlara alınmıştır. Ekstraksiyon sonucu kavanozlara alınan etil asetat fazları içinde asidik serbest- JA bulunmaktadır.

V) Beherlerde kalan su fazlarının pH’sı 4 N NaOH kullanılarak, 11’e ayarlanmıştır.

VI) Beherlerin ağızları fazla sıkı olmamak üzere alüminyum folyo ile kapatılarak 1 (bir) saat, 70 °C de su banyosunda bırakılmıştır.

VII) Bir saat sonra beherler sıcak su banyosundan çıkarılmış (alkali hidroliz işlemi) ve içlerindeki su fazlarının pH’sı 4 N HCl kullanılarak 2.5’e ayarlanmıştır.

VIII) pH’sı 2.5’ e ayarlanan ve 250 ml’lik ayırma hunilerine alınan her bir örnek üzerine 15 ml etil asetat konulmuştur. Bu ayırma hunileri kuvvetli olarak 3-4 kez çalkalanmış ve etil asetat ile su fazındaki JA’in etil asetat fazına geçmesi sağlanmıştır. Daha sonra, dinlenme sırasında etil asetat ve su fazları birbirinden net olarak ayrılmıştır. Ayırma hunisindeki musluk yardımıyla, altta kalan su fazı bir behere, üstteki etil asetat fazı ise serbest JA’in bulunduğu kavanoza alınmıştır. İşlem 3 kez tekrarlanmıştır. Böylece ekstraksiyon sonucu kavanoza alınan etil asetat fazları içinde bağlı iken serbest ve bağlı–JA bulunmaktadır. Daha sonra bu kavanozlar derin dondurucuda -18 °C’ de evaporasyon işlemine kadar saklanmıştır.

37

38 (Şekil 3.1’in devamı)

X) Derin dondurucudan çıkartılan ekstraktlar 250 ml’lik ekstraksiyon balonlarına alınmış ve 45 °C’de rotary-evaporatörde buharlaştırılmıştır. Evaporasyon işlemi sonucunda balonların çeperlerine yapışan ve hormonları içeren kuru kalıntılar 1 ml metanol ile çözülerek ependorf tüplerine alınmıştır.

XI) Daha spesifik ayrım yapabilmek için Sep-Pak C18 (Waters) kartuşları kullanılmış ve kartuşlar kullanılmadan önce şartlandırılmıştır. Kartuşlar 2.5 ml % 80’lik metanolden geçirildikten sonra, 2.5 ml HPLC grade suyla yıkanıp, 2.5 ml kuru hava geçirilmek suretiyle kullanıma hazırlanmıştır. Berrak kısımlar 5 ml’lik şırıngalarla şartlandırılmış Sep-Pak C18 kartuşlarından 1 ml/dk akış

39

hızıyla geçirilmiştir. Kartuşlar tarafından adsorbe edilen hormonlar 2.5 ml % 80’lik metanol ile çözünmek suretiyle falkon tüplerine alınmıştır.

XII) Falkon tüplerine alınan numunelerden 20 µl alınarak manuel enjeksiyon ile HPLC sistemine enjekte edilmiştir.

3.2.5.2. Sıvı kromatografi (HPLC) analiz şartları

Bitkisel hormonların HPLC ile analizleri aşağıda verilen konfigürasyona göre yapılmıştır.

a) Pompa: Basıncı 400 bar’a kadar çıkabilen Agilent 1200 marka (G1311 A

model) 4’lü pompa (quaternary pump) kullanılmıştır.

b) Dedektör: Agilent 1200 marka ve G1315 D model DAD dedektör (Diode Array

Dedektör) kullanılmıştır.

c) Kolon: C18-dolgulu Agilent marka (4.6 mm x 150 mm, 5 µm) kolon

kullanılmıştır.

d) Degaz işlemi: Agilent 1200 marka G1322 A model degasser kullanılarak mobil

fazda oluşan gazlar uzaklaştırılmıştır. Ayrıca; mobil faz hazırlandıktan sonra oluşan gazlar, ultrasonik su banyosu (Bandelin Sonorex) ile uzaklaştırılmıştır.

e) Kaydedici (Integrator): Dedektörün gönderdiği uyartılar “Chemstation” adlı

yazılım kullanılarak bilgisayar ortamına kaydedilmiştir.

f) İzokratik sistem: İzokratik sistem, sabit konsantrasyondaki mobil fazın 1.0

ml/dk. akış hızı ile beraber maddelerin kolonlardaki alıkonma zamanına bağlı olarak birbirlerinden ayrılabilmesi temeline dayanmaktadır.

g) Mobil (sürükleyici) faz: Jasmonik asidin belirlenmesinde mobil faz olarak,

metanol ve % 1’lik asetik asit çözeltisi (55:45 v/v (HPLC grade, Merck ) kullanılmıştır.

h) UV absorbans değerleri: JA için 280 nm’ye ayarlanmıştır (Gundlach vd 1992,

Martinez-Medina vd 2010).

i) Kolon sıcaklığı: Sistemde Agilent 1200 marka G1316 A model termostatlı

40

j) Akış hızı: 1 ml/dk olarak belirlenmiştir.

k) Enjeksiyon hacmi: Agilent 1200 marka G1328 B model manuel enjeksiyon

bloğuna 20 µl örnek enjekte edilmiştir.