Hipoksiya, HIF-1α ve CA

CAIX geninin promotoru DNase I footprinting’den korunan 5 bölge içermektedir. Bunlar transkripsiyon başlama noktasından başlayarak PR1-PR5 bölgeleridir. PR1 ve PR2 bölgeleri SP1/3 ve AP1 transkripsiyon faktörlerine bağlanır ve CAIX transkripsiyonunun aktivasyonu için kritik öneme sahiptirler. PR4 delesyonu ise promotor aktivitesinde artışa neden olduğu için, transkripsiyonu negatif yönde etkilediği ve baskılayıcı olarak görev yaptığı bulunmuştur. CAIX geninin transkripsiyon başlangıcı ve PR1 bölgesi arasındaki promotor dizisi HRE (hypoxia response element) bağlanma domaini içerir ve bu element HIF1 (hipoxia inducible factor) tarafından tanınır. HIF1 ise hipoksiyaya yanıt olarak transkripsiyonun kontrolünü sağlar [113,114].

Şimdiye kadar karakterize edilen bütün HRE’ler yapısal olarak korunmuş G/ACGTg şeklinde HIF bağlanma bölgesi (HBS= HIF binding site) dizilerine sahiptirler. Korunmuş HBS bölgesi hipoksiya tarafından aktivasyon için gereklidir ancak tek başına HBS yeterli değildir. Korunmamış fakat fonksiyonel olarak kritik önemli olan diziler, HRE’nin bütünleyici parçalarıdır. TACGTG şeklindeki HBS, transkripsiyonun başlangıç noktasının hemen üst kısmındadır (-3,-10bp). HBS bölgesinde mutasyona sahip olan CA9 promotorunun inaktive olmasından ve HIF1-α

21

içermeyen hücrelerde hiç promotor aktivitesinin gözlenmemesinden dolayı, CA9 promotorundaki en kritik düzenleyici element HBS bölgesidir. Bu durum, HIF 1 kompleksinin CA9 promotorundaki HRE’ye bağlanmasının transkripsiyonel mekanizma için ilk koşul olduğunu desteklemektedir

CA9 promotorunda HRE bölgesinin tanımlanmasından sonra yapılan çalışmalar sonucu elde edilen bilgiler, CA9 regülasyonundaki HIF-1 yolağının kritik rolünü destekler nitelikte olmuştur. CA9 transkripsiyonunu kontrol ettiği bilinen yolakların, faktörlerin ve deneysel koşulların büyük kısmının, HIF-1α stabilitesini regüle ederek ya da HIF-1 transkripsiyonel aktivitesini kontrol ederek veya her ikisini birlikte yaparak HIF-1α yolağı üzerinde birleşiyor olması dikkate değer bir durumdur. Hipoksiya ile indüklenebilen genlerin HRE’lerine bağlanarak transaktive eden HIF transkripsiyon faktörü O2 tarafından kontrol edilen α ve sürekli sentezlenen β alt ünitelerinin birleşiminden oluşan bir heterodimerdir. HIF-1α iki farklı tipteki oksijen sensörü aracılığıyla regüle edilmektedir. Bunlardan birincisi oksijen bağımlı degredasyon domaininin hidroksillenmesini içerir. Oksijen varlığında, prolil-4- hidroksilazlar tarafından HIF-1α’nın oksijen bağımlı degredasyon domainindeki (ODDD) 462. ve 564. prolin rezidülerinin hidroksillenmesi sağlanır. Hidroksillenmiş domainler, HIF-1α’nın von Hippel Lindau (VHL) proteinleri tarafından özel olarak tanınmasını sağlar. VHL ve diğer protein bileşenleri, E3 ubikitin-ligaz kompleksi oluşturarak, HIF-1α’nın ubikitinilasyonuna sebep olurlar ve bu durum HIF-1α proteinin 26S proteozom tarafından degredasyonsouçlanır. Fakat hipoksi koşullarında, bu aminoasitler oksijen azlığından dolayı hidroksilazlar tarafından modifiye edilemezler. Böylece VHL aracılığı ile degredasyon ve HIF-1 aracılığı ile inaktivasyon engellenir. Bu durum ise ortamda HIF-1α ’nın birikmesine, HIF-1α ile β’nın dimerler oluşturmasına, hedef genlerdeki HRE bölgelerine bağlanmaya, kofaktörler ile etkileşmesine neden olur ve HIF-1 transaktivasyon kapasitesi uyarılır. Bunun dışında, HIF-1α, normal oksijen koşullarda farklı hücre dışı sinyaller aracılığıyla, PI3K ile MAPK sinyal iletim yolları gibi yollar aracılığı ile ya da onkojenik değişiklikler ile de artabilir.

ODDD’ye ek olarak, HIF-α, N-terminal (NAD) ve C-terminal (CAD) olmak üzere 2 adet aktivasyon domaini içermektedir. Transkripsiyonel regülasyonda

22

görevli ikinci tipteki oksijen sensörü, CAD’nin transkripsiyonel aktivitesinin regülasyonunu kontrol etmektedir. Bu kontrolü oksijen bağımlı-asparajinil hidroksilaz faktör inhibitörü (FIH-1) aracılığıyla yapar. FIH-1, HIF-1α’nın CAD bölgesinde bulunan N803 asparajin rezidüsünü hidroksilleyerek, transkripsiyonel ko- aktivatörler olan p300/CBP ile etkileşmelerini engellemektedir.

Şekil 1.8: Normal oksijen ve hipoksik koşullarda CA9 geninin regülasyonu [70]

HIF-1 hipoksiya koşullarında CAIX’un transkripsiyonunu güçlü şekilde aktive eder fakat tam bir aktivasyon için SP1/3 transkripsiyon faktörünün PR1 e bağlanması gereklidir [3].

CA9 regülasyonunda hipoksiyanın direkt rolü, in vivo tümör örneklerindeki CA9 immuno tarama çalışmalarından ortaya çıkarılmıştır. Bu örneklerde CA9’un hipoksik bölgelerle güçlü şekilde sınırlandığı gözlenmiştir. Ayrıca CA9 ekspresyonunda hipoksiya ve HIF-1’in dikkat çekici etkisi in vitro olarak da

23

gösterilmiştir. Buna göre hücre hatlarının büyük bir kısmında yalnızca hipoksik koşullarda CA9 ekspresyonu gözlenmektedir. Elde edilen bu bulgular, HIF yolağının, CA9 için önemli olduğunu desteklemiştir.

Hipoksiyaya ek olarak, diğer ajanlar ve genetik faktörlerde HIF yolağını inhibe edebilir ve CA9 ekspresyonunu indükleyebilir. Mutasyonların inaktivasyonu ya da VHL’nin epigenetik olarak susturulması, genellikle böbrek hücre kanseri (renal cell karsinoma, RCC) durumlarında, direkt olarak CA9’un ve diğer hipoksiya ile indüklenebilen genlerin aşırı derecede ifadesi ile bağlantılıdır, hatta bu durum normal oksijen koşullarında da görülür. Bu VHL mutasyonları HIF-bozunma yolağını poliubikitilasyon basamağında bozar ve transkripsiyonel olarak aktif HIF’lerin toplanmasına neden olur. PHD’ler ve FIH-1 hidroksilazlar aynı faktörlere (oksijen, demir, oksoglutarat) bağımlıdırlar ve bunların birlikte inhibisyonları da aktif HIF’lerin toplanmasına neden olur. Bu hidroksilazların inhibisyonu örneğin demir şelatları, demir analogları, 2-OG analoglarının tümü CA9 ekspresyonunun güçlü aktivatörleridirler. HIF-1 fonksiyonu için transkripsiyonel yardımcı aktivatör olan p300/CBP’nin kritik rolü ile ilgili olarak, p300/CBP’nin yarışmalı inhibitörü olan adenoviral E1A’nın aşırı ifadesi, RCC hücrelerindeki CA9 ekspresyonunu güçlü şekilde azaltabilmektedir.

Toplu olarak bakıldığında, elde edilen çalışmalar güçlü şekilde hipoksiyanın CA9 regülasyonunda önemli olduğu görülmektedir fakat CA9, hipoksiya ve in vivo katı tümörlerdeki hipoksiya markerları arasındaki korelasyon kesin değildir ve kontrolde diğer mekanizmalar etkili olabilirler.

1.8 Sitokinler

Hücresel düzenleyici proteinler olan sitokinler, çeşitli uyarılara karşı cevap olarak özel hücreler tarafından salgılanarak hedeflenen hücrelerin davranışlarını etkileyen moleküllerdir. Her sitokin özgün hücre yüzey reseptörüne bağlanarak, hücre içi sinyal yolaklarının fonksiyonlarının değişimine sebep olur. Bu değişimler diğer moleküller için hücre yüzey reseptör sayısının artması ya da hücrenin kendi etkilerinin değişmesi şeklinde olabilir. Çoğu sitokinlere hücresel yanıt hedef

24

hücrelerde gen ifadesinde değişimler ile meydana gelir ve böylece hücreler yeni fonksiyonlar geliştirebilir ya da prolifere olabilir [28].

Sitokinlerin tanımlanması ve karakterize edilmesi çeşitli isimlendirme ve sınıflandırma sistemine göre yapılmıştır. Bu sınıflandırma sitokinler arasındaki yapısal ve fonksiyonel benzerlikler ile etki mekanizmalarına dayanmaktadır. Sitokinler başlıca şu ana gruplara ayrılmaktadır:

1) Büyüme faktörleri (Epidermal büyüme faktörü, EGF; Platelet orijinli büyüme faktörü, PDGF; insülin benzeri büyüme faktörü-1, IGF-1; Inüsilin benzeri büyüme faktörü-2, IGF-2; Sinir büyüme faktörü, NGF; Asidik fibroblast büyüme faktörü, aFGF; Basik fibroblast büyüme faktörü, bFGF; Neurolökin; Amfiregulin; Hepatosit büyüme faktörü, HGF v.b.)

2) Lenfokinler (interlökin-1a, IL-1a; II-1b; IL-2; IL-3; IL-4; IL-5; IL-6; IL-7; IL-8; IL-9; IL-10; IL-11; IL-12; IL-13; IL-14; IL-15)

3) Koloni sitimüle eden faktörler (Granülosit/makrofaj koloni sitimüle eden faktör, GM-CSF; Granülosit-CSF; Multi-CSF; Eritropoietin, EPO; Lösemi inhibitör faktör, LIF)

4) Transforme edici büyüme faktörleri (TGF-α; TGF- β) 5) Tümör nekroz faktörleri (TNF-α; TNF-β)

6) Interferonlar (IFN-α; IFN- β; IFN-γ)

1.8.1 TGF-β

TGF-β ailesi hücre proliferasyonu, farklılaşması, motilitesi, adezyonu ve ölümü gibi birçok hücresel süreçte yer alan ve gelişimi çok yönlü kontrol eden ekstraselüler büyüme faktörlerinin büyük bir grubudur. İnsanlarda bulunan üç farklı TGF-β (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3) ilk sentezlendiklerinde öncül protein şeklindedir ve oldukça büyük yapılıdırlar. Daha sonra işlenerek olgun protein haline gelen TGF- β ailesi, TGF-β kendisi başta olmak üzere, BMP (Bone Morphogenetic Protein), Aktivinler ile büyüme ve farklılaşma faktörleri olmak üzere 30’dan fazla üyeye sahiptirler. TGF-β ailesi üyeleri transmembran protein ailesinden olan serin/treonin kinaz aktivitesine sahip, TGF-β reseptörlerine bağlanarak hücresel hareketlerini başlatırlar. TGF-β reseptör ailesi (TBR) yapısal ve fonksiyonel özellikleri göz önüne

25

alınarak tip I (TBR-I) ve tip II (TBR-II) reseptörler olarak 2 alt gruba ayrılırlar. Bu reseptörler sinyalin SMAD transkripsiyon faktörleri aracılığıyla çekirdeğe ulaşmasını sağlarlar. TGF-β sinyal ileti yolundaki eksiklik ya da hasarlar, örneğin SMAD mutasyonları, insanlardaki birçok kanser türü ile ilişki bulunmuştur. TGF-β aktivasyonundan önce, reseptörler tarafından regüle edilen SMAD proteinleri, SARA (SMAD Anchor Receptor Activation) aracılığıyla hücre membranına bağlı olarak bulunurlar. SARA’lar ayrıca SMAD proteinlerinin TGF reseptör kinazlarının yakınına taşınmasını sağlar. TGF-β’nın bağlanması ile sürekli aktif olan TGFβ_reseptör 2 tarafından TGFβ_reseptör 1’in aktivasyonu ve fosforilasyonu sağlanır. Aktive olan TGFβ_reseptör 1, SMAD2 ve SMAD3’ü fosforile eder. Fosforile olan SMAD2 ve SMAD3, SMAD4’e bağlanır ve çekirdeğe hareket ederler. Çekirdekte transkripsiyonu regüle etmek için kompleks oluştururlar. SMAD transkripsiyon faktörleri transkripsiyonu farklı şekillerde regüle ederler; örneğin direkt DNA’ya bağlanabilirler veya diğer transkripsiyon faktörlerine bağlanarak indirekt olarak regülasyon sağlarlar. Bunun dışında transkripsiyon represör ya da aktivatörleri ile etkileşerek (p300 ve CBP) transkripsiyonu regüle ederler (Şekil 1. 9) [115].

Çekirdek hormon reseptörünün ko-represörü olan N-CoR ile etkileşen transkripsiyonel bir represör olan SnoN onkoproteinlerinin, SMAD proteinleri ile etkileşimleri sonucunda, TGF-β ile indüklenen genlerin baskılanmasına ve TGF-β yolağının negatif feedback ile regülasyonunu sağladığı bulunmuştur [116].

MAP Kinaz ve ERK yolaklarının da TGF-β tarafından aktive edildikleri ve bu yolaklar aracılığıyla, SMAD proteinlerini etkiledikleri görülmüştür. MAP Kinaz yolağının ökaryotik hücrelerdeki gen ifadesinin regülasyonunda önemli görevleri vardır. MAP Kinazlar transkripsiyon faktörlerini fosforilleyerek gen ifadesini düzenlerler. Bazı çalışmalar ERK yolağının SMAD proteinlerinin transkripsiyonel aktivitedeki pozitif etkilerini gösterirken, bazıları ise SMAD1, SMAD2 ve SMAD3’ün, ERK yolağı ile fosforilasyonunun, bu proteinlerin çekirdeğe yerleşimini engellediğini ve böylece SMAD aracılı transkripsiyonu inhibe ettiğini göstermiştir. Dolayısıyla SMAD regülasyonundaki ERK yolağının etkisi hücresel yapıya bağlı olarak değişiklik gösterir [117].

26

27

1.8.2 IL-6

IL-6 hücre büyümesi, genlerin aktivasyonu, proliferasyon ve farklılaşma süreçlerini regüle ederek geniş bir spektrumdaki hücresel ve fizyolojik cevaplarda, örneğin immun cevap, inflamasyon, hematopoez ve onkogenezde önemli roller üstlenmiştir. T-hücreleri ve makrofajlar tarafından salgılanarak inflamasyona cevapta önemli rol oynarlar. Özellikle kaslarda ve yağ dokularında enerji metabolizmasında görev alarak vücut sıcaklığının düşmesini sağlar [119].

Birçok hücre yüzeyinde bulunan IL-6 reseptörleri iki alt üniteden oluşmaktadır (Şekil 1.10). Özellikle hücre hatları ile yapılan çalışmalarda hepatoma ve ilik (myeloid) hücre hatlarında da IL-6 reseptörlerinin bulunduğu gösterilmiştir. IL 6 reseptörünün alfa alt ünitesi ligand spesifikliğini sağlarken, diğer alt ünite GP 130 (Glikoprotein) ise IL-6 ailesindeki tüm reseptörler ile ortak özellikler taşır. IL-6’in reseptörüne bağlanması ile JAK Kinazların (Janus Kinases) ve Ras-aracılı yolakların aktivasyonu sağlanır (Şekil 1.10). Aktive olmuş JAK Kinazlar, STAT3 (Signal Transducers and Activators of Transcription-3) ve SHP2 [SH2 (Src Homology-2) Domain-containing Tyrosine Phosphatase] transkripsiyon faktörlerini fosforilleyerek aktive ederler. Fosforillenen STAT3 dimer oluşturarak çekirdeğe gider ve STAT3 bağlanma dizisi içeren genlerin regülasyonunu sağlar. Ras-aracılı yolakta ise aktive olan JAK kinazlar SHP2 yi fosforilleyerek, GRB2, SHC ve Ras aracılığıyla sinyalin MAPKinaz yolağına ulaşması sağlanır ve Elk1 ve NF-IL-6 (C/EBP-β) gibi transkripsiyon faktörlerinin aktivasyonu sağlanır [120-122] (Şekil 1.10).

28

Şekil 1.10: IL-6 aracılığı ile gen ifadesinin kontrolü [122].