Amostras de tecidos incluídas em parafina foram obtidas da Divisão de Anatomia Patológica do Departamento de Patologia do HC-FMUSP.
O presente estudo foi aprovado pela Comissão de Ética para análise de Projetos de Pesquisa da Diretoria Clínica do HC-FMUP (Protocolo de Pesquisa N° 851-05, Anexo 7). Todos os pacientes foram informados da natureza do projeto de pesquisa e assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo 8).
TABELA 8: CASUÍSTICA DE ACORDO COM O GRAU DE ASTROCITOMA
(OMS). Histopatologia N° de casos AP 22 AGII 22 AA 17 GBM 84 NT 17 Total 162
3.2 – Extração de DNA de Tecido Tumoral
O tecido tumoral foi congelado em nitrogênio líquido e pesado. Para cada 0,1 g de tecido foram adicionados 1000 µL de tampão de lise (NaCl 150 mM, EDTA 25 mM em pH 8,0), 20 µL de proteinase K (10 mg/mL) e 20 µL de SDS 10%. A mistura foi incubada a 37ºC por uma noite. Posteriormente, foi feita uma centrifugação por 15 min a 14.000 rpm. Foram adicionados para cada 500 µL de sobrenadante, 250 µL de fenol pH 8,0 e 250 µL de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1). Após centrifugação de 5 min a 14.000 rpm, foi removido o sobrenadante ao qual foi adicionado 500 µL de clorofórmio e novamente centrifugado. Ao sobrenadante foram adicionados 40 µL de NaCl 0,4 M e 1000 µL de etanol absoluto gelado, homogeneizado e mantido a -20ºC por uma noite ou mais. O precipitado foi obtido após centrifugação de 15 min a 14.000 rpm, seco e ressuspenso em 50 µL de água MilliQ. Em seguida, foram adicionados a esta solução 25 µL de NH4Ac
7,5 M e 300 µL de etanol absoluto gelado, e centrifugado por 5 min a 14.000 rpm. O precipitado foi lavado com 1000 µL de etanol 70%, seco em temperatura ambiente e ressuspenso em tampão TE-4. As concentrações das amostras de DNA foram determinadas através de leitura em espectrofotômetro em comprimento de onda de 260/280 nm no aparelho ND-
1000 Spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Inc), em que se considerou satisfatório razões que variavam de 1,8 a 2,0. As amostras-mãe foram diluídas para concentração de 100 ng/µL e armazenadas a 4ºC até a utilização.
3.3 – Extração de RNA
Os tecidos foram analisados em um corte de 4μm por coloração com hematoxilina e eosina a fim de se verificar a qualidade do tecido. Porções de tecidos não tumorais foram dissecados previamente à extração de RNA. O RNA total foi extraído com Mini Kit RNeasy (Qiagen Inc, Hilden, Germany). A qualidade das amostras foi verificada através de corrida eletroforética em gel
denaturante de agarose e as concentrações das mesmas foram determinadas através de leitura em espectrofotômetro em comprimento de onda de 260/280 nm no aparelho ND-1000 Spectrophotometer (NanoDrop
Technologies, Inc), em que se considerou satisfatório razões que variavam
de 1,8 a 2,0. As amostras-mãe foram estocadas a -70ºC e uma alíquota foi utilizada para a transcrição reversa.
3.4 – Síntese da Primeira Fita de DNA Complementar (cDNA)
Para cada 7,0 µL (2 µg) de RNA a ser reversamente transcrito, acrescentou-se 0,2 µL de DNase (10 U/µL), 0,3 µL de água MilliQ, 2,0 µL do tampão de síntese 5X (First Strand Buffer; Invitrogen) e 0,5 µL de inibidor de RNase (RNaseOUT, Invitrogen). Este produto foi incubado por 10 min a temperatura de 37°C e por 5 min a temperatura de 75°C.
A seguir, foram adicionados a cada amostra 0,09 µL de Random
Primers (3 µg/µL; Invitrogen), 0,5 µL de Oligo dT (0,5 µg/µL, Invitrogen), 1,0
µL de solução com mistura de dNTPs (10 mM; Invitrogen) e 0,41 µL de água MilliQ. Em seguida, as amostras foram incubadas por mais 10 min a temperatura de 75°C.
Ao final deste processo, as amostras foram imediatamente resfriadas (etapa realizada no gelo) e foram acrescentados a cada amostra 2,0 µL do tampão de síntese 5X (First Strand Buffer; Invitrogen), 1,0 µL de DTT 0,1 M (Invitrogen), 0,5 µL do inibidor de RNase, 3,5 µL de água MilliQ e 1,0 de transcriptase reversa (SuperScript III Reverse Transcriptase 200U/µL; Invitrogen). As amostras foram levemente homogeneizadas e novamente incubadas por 5 min a temperatura de 25°C, 60 min a 50°C e 15 min a 70°C.
Após esta etapa, as amostras foram diluídas em TE-4 e armazenadas em - 20°C.
3.5 – Seleção dos Primers
A seleção de todos os primers do estudo obedeceu aos seguintes critérios: temperatura de anelamento semelhante (60°C), produtos de PCR de tamanho inferior a 200 kb, concentração de G/C entre 40-60%, e a presença de no máximo dois nucleotídeos C e/ou G na extremidade 3’.
Todos os primers foram sintetizados pela IDT (Integrated DNA
Technologies, Inc, Coraville, IA) e utilizados numa concentração final de 10
pmol/μL para a reação de RT-PCR; 0,8 pmol/μL para a análise da expressão, e amplificação, e 3,2 pmol/μL para a análise da deleção do gene EGFR. Para a análise da expressão do gene IL-13Rα2 foi utilizado o primer
numa concentração de 1,6 pmol/μL.
3.6 – Deleção EGFRvIII por Reação em Cadeia de Polimerase Transcrição Reversa (RT-PCR)
A presença da deleção EGFRvIII foi verificada através da técnica de RT-PCR.
Primeiramente, foi desenhado um par de primers nas regiões que flanqueiam o final do exon 1 (sense) e a junção dos exons 8 e 9 (antisense). Na ausência da deleção EGFRvIII, o fragmento amplificado foi de 954 pb, enquanto que na presença da mesma, o fragmento amplificado foi de 153 pb. Para confirmar a presença da deleção nas amostras com amplificação da banda menor de 153 pb, novas reações de PCR foram realizadas com dois pares de primers: um específico para a forma selvagem utilizando-se a seqüência sense do anterior e o antisense flanqueando a junção entre os exons 3 e 4 com 364 pb, e outro específico para a forma truncada, utilizando-se o antisense do primeiro par e o sense flanqueando a junção entre os exons 1 e 8, exatamente na deleção, com 140 pb (Figura 12).
FIGURA 12. Figura esquemática do desenho de primers para a reação de RT-PCR. A: par de primers geral para a deleção EGFRvIII. B: pares de primers específicos para as
formas selvagem (EGFRwt) e deletada (EGFRvIII). Os números indicam os exons escolhidos para o desenho e as setas indicam as junções dos mesmos.
As seqüências sense e antisense dos primers utilizados nas reações de RT-PCR e os parâmetros de amplificação constam na Tabela 9.
As reações de PCR foram realizadas utilizando-se 2 µL de cDNA, amostras aliquotadas em concentrações de 50 a 100 ng/µL, em tampão Tris-
HCl 10 mM (pH 9,0), KCl 50 mM, contendo 2 mM de MgCl2 , mistura de
dNTPs a 2,5 mM, 10 pmol de cada primer e 1 unidade de enzima Tth (Biotools, Madri, Espanha), em volume final de 20 µL.
As reações de PCR foram realizadas no termociclador (PTC – 200, MJ
Research Peltier Termal Cycler, Watertown, EUA) e consistiram de uma
denaturação inicial de 94ºC durante 5 min, seguida por 35 ciclos de denaturação por 30 s a 94ºC, anelamento de 30 s a uma temperatura de 58ºC e uma extensão por 60 s a 72ºC. Por fim, foi realizada uma extensão final por 10 min a 72ºC. A reação foi mantida a 4º até sua análise por eletroforese em gel de agarose 2%.
Os produtos de PCR foram analisados quanto à eficiência da reação e tamanhos dos produtos esperados em eletroforese em gel de agarose 2% em uma corrida efetuada em tampão TAE 1X, e corados em brometo de etídio. 1 1 33 44 EGFRwt 1 1 88 99 EGFRvIII EGFRvIII B 1 1 33 44 11 88 99 EGFRvIII EGFRvIII B 1 1 33 44 EGFRwt 1 1 88 99 EGFRvIII EGFRvIII B 1 1 33 44 11 88 99 EGFRvIII EGFRvIII B 1 1 88 99 EGFRvIII EGFRvIII A 1 1 88 99 EGFRvIII EGFRvIII A