Hatalı Görülen EMG (Artefakt)

Devido ao caráter polar desta fração optou-se por utilizar somente cromatografia por exclusão utilizando sephadex LH-20. 1,5 g do extrato foi

FAA11.1 12mg FAA11 132mg Sephadex (15h x 1,5Ø cm) metanol FAA11.5 15mg FAA11.2 13mg FAA11.3 57mg FAA11.4 12mg

solubilizado em acetona/metanol (2:1) de onde se formou um precipitado de coloração amarela, este precipitado foi separado por centrifugação e lavado várias vezes com a mesma mistura de solventes e foi nomeado de FAMP (75 mg).

O material solubilizado foi refracionado após evaporação do solvente através de cromatografia em coluna com sephadex LH-20 (90h x 5Ø cm) tendo metanol como eluente, 1,5 g do filtrado foi adicionado ao topo da coluna e foram coletadas 8 novas frações (Fluxograma 3.8) que foram nomeadas de FAM1 a FAM8. Após estarem secas foi realizado análise por CCD (utilizando vapor de amônia e vanilina ácida como reveladores).

FLUXOGRAMA 3.8 – Fracionamento da partição FAM

3.7.2.1. ISOLAMENTO DA SUBSTÂNCIA FA13

O precipitado FAMP, após estar bem seco, foi analisado por CCD (vapor de amônia e vanilina ácida) de onde se verificou um alto grau de pureza, e após experimentos de RMN se confirmou tratar de uma substância pura (FA13).

3.7.2.2. ISOLAMENTO DAS SUBSTÂNCIAS FA14, FA15 E FA16

A fração FAM3 apresentou-se como um sólido de coloração laranja amarronzado e foi refracionado utilizando cromatografia por exclusão utilizando sephadex LH-20 (30h x 4Ø cm) eluído com metanol. 310 mg do material foi solubilizado em quantidade mínima de metanol e adicionado no topo da coluna, de onde foram obtidos 15 novas frações, que após análise por CCD (vapor de amônia e vanilina ácida), foram agrupadas em 5 novas frações e renomeadas por FAM3.1 a FAM3.5 (Fluxograma 3.9). Após estarem secas, elas foram submetidas a experimento de RMN 1H e a fração FAM3.3 apresentou sinais de flavonóides e esta fração foi recromatografada utilizando sephadex LH-20 (15h x 2,5Ø cm) tendo como

FAM 1500mg Sephadex (90h x 5Ø cm) metanol FAM8 78mg FAM7 130mg FAM6 45mg FAM5 177mg FAM4 289mg FAM3 310mg FAM2 23mg FAM1 100mg

eluente metanol. Seguindo o mesmo procedimento já descrito, a fração foi solubilizada em metanol e adicionada no topo da coluna e após foram recolhidas 3 novas frações (eram recolhidas com acompanhamento de luz UV-Vis) de onde foram renomeadas de FAM3.3.1 a FAM3.3.3. A fração FAM3.3.2 apresentou-se com um grau mediano de pureza e optou-se por purificá-la por CLAE.

FLUXOGRAMA 3.9 – Refracionamento de FAM3

A fração FAM3.5 também foi recromatografada utilizando sephadex LH-20 (15h x 2,5Ø cm) tendo como eluente metanol e foram recolhidas também 3 novas frações (eram recolhidas com acompanhamento de luz UV-Vis) nomeadas de FAM3.5.1 a FAM3.5.3. A fração FAM3.5.3 após experimento de RMN 1H mostrou-se tratar de uma mistura de duas substâncias e optou-se por purificá-la por CLAE.

As condições de separação para FAM3.3.2 foram: coluna semi- preparativa (30h x 0,78Ø cm) fenil-hexil; modo reverso de eluição: ACN 75%; detector: UV-Vis 254 e 270 nm; fluxo: 4 mL/min; seringa 200 µL num looping de 200 µL.

Para a fração FAM3.3.2 foram realizadas 12 injeções. O cromatograma (Figura 3.7) mostra o aparecimento de muitas bandas iniciais que foram descartadas e a banda principal foi coletada, sem haver reciclo, sendo renomeada

Sephadex (15h x 2,5Ø cm) metanol

FAM3.2 35mg FAM3.1

21mg FAM3.3 100mg FAM3.4 60mg FAM3.5 89mg FAM3 310mg

Sephadex (30h x 4Ø cm) metanol

FAM3.3.1

23mg FAM3.3.2 45mg FAM3.3.3 28mg FAM3.5.1 15mg FAM3.5.2 52mg FAM3.5.3 17mg

FAM3.3.2 A 18mg FAM3.5.2 A 10mg FAM3.5.2B 19mg Sephadex (15h x 2,5Ø cm) metanol

de FAM3.3.2A e após estar seca foi realizado experimento de RMN 1_{H onde se}

constatou que era uma substância pura (FA14).

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 0 100 200 300 400 Abs tempo

FIGURA 3.7 – Cromatograma de CLAE da fração FAM3.3.2.

As condições de separação para FAM3.5.2 foram: coluna semi- preparativa (30h x 0,78Ø cm) fenil-hexil; modo reverso de eluição: ACN 75%; detector: UV-Vis 254 e 270 nm; fluxo: 4 mL/min; Seringa 200 µL num looping de 200 µL. Para a fração FAM3.5.2 foram realizadas 14 injeções. O cromatograma (Figura

3.8) mostra o aparecimento de duas bandas que foram recicladas e coletadas no

segundo reciclo A primeira banda, chamada de A e a segunda, chamada de B. Após as 4 injeções, todas as frações de bandas iguais foram agrupadas e renomeadas de FAM3.5.2A e FAM3.5.2B e após estarem secas foi realizado experimento de RMN

1_{H onde se constatou que eram substâncias puras (FA15 e FA16).}

2 4 6 8 10 0 100 200 300 B A tempo A B

3.7.2.3. ISOLAMENTO DA SUBSTÂNCIA FA17

A fração FAM4 apresentou-se como um sólido de coloração laranja amarronzado e foi refracionado utilizando cromatografia por exclusão utilizando sephadex LH-20 (30h x 4Ø cm) eluida com metanol. 280 mg do material foi solubilizado em quantidade mínima de metanol e adicionado no topo da coluna, de onde foram obtidos 6 novas frações que foram numeradas de FAM4.1 a FAM4.6. Após estarem bem secas, estas frações foram submetidas a análise por CCD e a fração FAM4.4 foi novamente cromatografada utilizando sephadex LH-20 (15h x 2,5 Ø cm) eluído com metanol. 289 mg do material foi solubilizado em quantidade mínima de metanol e adicionado no topo da coluna, de onde foram obtidas 3 novas frações, que foram numeradas de FAM4.4.1 a FAM4.4.3 (Fluxograma 3.10).

FLUXOGRAMA 3.10 – Fracionamento de FAM

Para a fração FAM4.4.2, após experimento de RMN 1_{H, optou-se por}

purificar por CLAE e as condições de purificação foram: coluna semi-preparativa (30h x 0,78Ø cm) fenil-hexil; modo reverso de eluição: ACN 75%; detector: UV-Vis 254 e 270 nm; Fluxo: 4 mL/min; seringa 200 µL num looping de 200 µL.

Para a fração FAM4.4.2 foram realizadas 6 injeções. O cromatograma (Figura 3.9) mostra o aparecimento de cinco bandas de onde foram descartadas as

Sephadex (15h x 2,5Ø cm) metanol FAM4.2

25mg FAM4.1

13mg FAM4.3 13mg FAM4.4 63mg FAM4.5 37mg FAM4 280mg Sephadex (30h x 4Ø cm) metanol FAM4.4.1 25mg FAM4.4.2 23mg FAM4.4.3 10mg FAM4.4.2A 5mg FAM4.6 43mg CLAE (a)

minoritárias e coletada a banda majoritária que foi renomeada de FAM4.4.2A e após estar seca, foi realizado experimento de RMN 1H onde se constatou que era uma substância pura (FA17).

0 10 20 30 40 0 50 100 150 200 Abs tempo

FIGURA 3.9 – Cromatograma de CLAE da fração FAM4.4.2.