1.7.1. Parametrik Metodlar:
Parametrik metodlar denilince temel olarak Bağlantı Analizi (Linkaj Analizi) akla gelir. Parametrik analizlerin kullanılabilmesi için aşağıdaki parametrelerin belirlenmesine ihtiyaç vardır:
a. Hastalığın kalıtım kalıbı kesin olarak tespit edilmelidir. b. Üç kuşaklı ya da daha geniş aileler tercih edilmelidir. c. Örnek toplama yaklaşımı kalıtım kalıbına göre yapılmalıdır.
Hastalığın kalıtım kalıbı analizlerde kullanılacak hipotezin belirlenmesine yardımcı olur. Örneğin otozomal dominant bir gen ile kalıtılan bir hastalık haritalanmak isteniyorsa örnek toparlama işlemi hasta bireylerin, eşleri ve tüm çocukları yanı sıra kan bağı olan bireylerin sadece kendileri şeklinde olmalıdır. Otozomal resesif bir hastalık söz konusu olduğu zaman ise sıklıkla taşıyıcı olan anne-baba ve tüm çocuklarının çalışmaya alınması yeterlidir.
1.7.2. Non- parametrik Metodlar:
Niteliklerin kalıtım kalıplarını belirlemek her zaman kolay değildir. Pek çok genetik nitelik multifaktoriyel kalıtım kalıbı gösterir ve bunlar için hipotez oluşturmakta zorluklar yaşanır. Yine her zaman birkaç kuşağı bir arada bulmak ve örneklemek olanaksızdır. Özellikle geç yaşta başlayan hastalıklarda genellikle önceki kuşaklar ölmüştür, genç kuşaklarda ise henüz hastalık ortaya çıkmamıştır. Bu durumda, eksiklikler göz önüne alınarak parametrelerden bağımsız olan non-parametrik metodlar diğer bir deyişle assosiasyon (ilişkilendirme) çalışmaları önerilmektedir (Akarsu 2002, Onkamo 2002).
34
Non-parametrik yaklaşımda, geniş pedigriler oluşturulmasına ihtiyaç yoktur; çünkü burada hastalıkla genetik belirleyicinin birlikte kalıtılması şartı aranmaz. Bunun yerine belirlenen bölgelerdeki aday genlerde aranan özelliğin var olup olmadığı araştırılır (Kong ve ark 2002).
Tablo 1.5. Genetik haritalama yöntemleri
İlişkilendirme çalışmalarında, toplumda evliliklerin rastgele olması ve test yapılan tarihten en az iki kuşak öncesi dönemden itibaren toplumda genetik karışım olmaması koşulu aranır. Ayrıca bu testler her aileden sadece bir etkilenmiş birey çalışılmasını gerektirir ve birden çok hastanın bulunduğu ailelerde geçerliliği düşüktür. Bu ilişkiyi değerlendirmek ve eş zamanlı olarak hastalık ve gösterge alelinin kuşaklar arası birlikteliğini değerlendirmek ve bağlantı hakkında da bilgi edinebilmek için kalıtımda dengesiz aktarım (TDT) testi kullanıma girmiştir. Bu test toplumdaki genetik yapılaşmadan etkilenmez. İlgilenilen alel açısından heterozigot bireyler ve hasta çocuklar incelenir. Aynı özellikleri barındıran bir diğer test de kardeşler arası dengesiz kalıtım (SDT)’dir. Burada ebeveyn ile ilgili veriye ihtiyaç duyulmamakla birlikte en az bir hasta ve bir sağlam kardeşin incelenmesi gereklidir (Akarsu 2002).
35
2. GEREÇ VE YÖNTEM 2.1. GEREÇ
2.1.1. Klinik değerlendirme
Bu çalışmada, Konya bölgesinden saptamış olduğumuz dört kuşak boyunca 19 bireyde hastalık gözlenen toplam 86 kişilik bir ailede otozomal dominant Herediter Sferositoz’a neden olan genlerin haritalanması planlandı. Gerek kalıtım modelinin tam olarak tespit edilebilmesi gerekse ailenin büyüklüğünün bağlantı analizlerini uygulamayı olanaklı kılması nedeni ile ailenin bilinen gen lokalizasyonları ile test edilmesi düşünüldü.
Proband, Selçuk Üniversitesi Meram Tıp Fakültesi Pediatrik Hematoloji polikliniğine başvuran ve tedavisi planlanıp, splenektomi yapılan 14 yaşında bayan hastaydı. Aile öyküsünden ailede pekçok kişide aynı kliniğin saptandığı ve opere edildikleri anlaşıldı. Ailelerle yapılan görüşmeler sonucunda, dört kuşaklı geniş bir aile pedigrisi elde edildi. Pedigri incelendiğinde HS’nin kalıtım kalıbının otozomal dominant formla uyumlu olduğu görüldü. Hemen hemen tüm aile bireyleriyle görüşüldü, arşivde bulunabilen dosyaları incelendi ve değerlendirildi. Gönüllü olarak çalışmaya katılmayı kabul eden aile bireyleri "bilgilendirilmiş onam formunu" (EK-1) imzaladıktan sonra çalışmaya dahil edildi.
HS’nin klinik belirtilerine tüm hasta bireylerde rastlanmıştır. Bu belirtiler kısaca; anemi, sarılık ve splenomegalidir. Periferik yaymada retikülosit ve sferositlerin varlığı ve artmış eritrosit osmotik frajilitesi tanı koydurucudur. Hastalara sık aralıklarla kan transfüzyonu yapılmış ancak bu tedavinin de geçici bir çözüm olması nedeniyle hastalar yine eski durumlarına döndüklerinden radikal tedavi olarak splenektomi planlanmış, hastaların hemen hepsinde HS’nin kliniğiyle uyumlu olarak splenektomi sonrası klinikte dramatik bir düzelme gözlenmiştir.
Otozomal dominant kalıtım kalıbıyla çalışmaya uygun olarak; hasta bireyler, eş ve çocuklarının periferik kanlarının alınması planlandı. Çalışmaya başlayınca hastaların evlerine gidilerek, otozomal dominant kalıtım kalıbına
36
uygun olarak toplam 24 bireyden steril enjektörlerle 10cc’lik periferik kan alındı. EDTA içeren tüplere boşaltıldı ve aşağı-yukarı sallanarak kanın EDTA ile tam olarak karışması sağlandı ve pıhtılaşmanın önüne geçildi. Tüplerin üzerine kişinin adı, soyadı ve pedigriye göre verilen numarası ve tarih yazılarak herhangi bir karışıklık olması engellendi. Kanlar daha sonra +4 °C ‘de en fazla 1 gün bekletilerek moleküler çalışmanın tamamlanacağı Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Araştırma Merkezi bünyesinde faaliyet gösteren Gen Haritalama Laboratuvarı’na götürüldü.
2.1.2. Pedigrinin Oluşturulması
Pedigri CYRILLIC 2.1 programıyla hazırlandı. CYRILLIC 2.1, bir pedigri çizim programı olmasının yanında; çizimden sonra polimorfik belirleyici genotiplerinin veri olarak girilmesi ile kromozomal haplotiplerin pedigri üzerinde görüntülenmesine de olanak sağlamaktadır.
37
Şekil 2.1. Ailenin pedigrisi
1 2 4 S1 6 8 10 3 19 15 S2 20 21 12 14 18 11 47 48 13 49 50 16 51 52 17 53 5 22 23 25 27 28 31 54-57 4 58-59 2 24 60 61 26 62 63 29 64-65 2 66 30 67 68 7 32 33-36 4 9 45 41 43 S5 38 S3 40S4 37 70 71 69 72 39 77 S8 78 73 74 S6 75S7 76 42 79 44 80 81 82 S9 46 83-84 2 85-86 2
38
2.1.3. Çözeltiler
2.1.3.1. DNA İzolasyon Tamponları 1. Nuclei Lysis Tamponu
10 mM Tris HCl 1.211 gr 400 mM NaCl 23.400 gr 2 mM Na2 EDTA 0.744 gr
Toplam 1 lt. olacak şekilde hazırlandı.
2. Proteinase K (10 mg/ml)
10 mg Proteinase K 1 ml 0.01 M Tris HCl 9 ml Distile su
Solüsyon Eppendorf tüplerine alınarak -20 °C’ de saklandı.
3. SDS Solüsyonu(%10 luk)
10 gr SDS 100 ml Distile su
Çözelti hazırlandıktan sonra filtre edilerek 37 °C ‘de saklandı.
4. Amonyum Asetat Solüsyonu (9.5 M)
36.613 gr Amonyum asetat 15 ml. Distile su
50 ml. 9,5 M amonyum asetat hazırlamak için 36.613 gr amonyum asetat 15 ml. distile su içinde çözüldü. Filtreden geçirildikten sonra +4°C’ de saklandı.
2.1.3.2. Agaroz Jel Elektroforez Tamponları 1. 10X TBE (Tris- Borik Asid-EDTA )Solüsyonu
108 gr (89 mM) Tris Base 55 gr (89 mM) Borik asit 40 ml. 0,5 M EDTA (pH= 8)
Karıştırıcıda çözülerek hazırlandı. 100 cc TBE + 900 cc distile su olacak şekilde % 10 luk TBE solusyonu hazırlandı.
39
2. 1X TBE Solüsyonu
1X TBE solüsyonu elde etmek için 10X TBE tampon çözeltisi 1:9 oranında distile su ile sulandırıldı.
3. Etidyum Bromid Çözeltisi (EtBr)
10 mg EtBr 1 ml Distile su
Çözelti hazırlanarak koyu renkli cam şişede saklandı.
4. Yükleme Tamponu
% 95 Formamid 940 µl 0.5 M EDTA 40 µl %0.05 Bromfenol blue 0.5 µl %0.05 Ksilen Siyanol 0.5 µl
Toplam hacim 1 ml. olacak şekilde hazırlandı. Çözelti +4°C’de saklandı.
5. %2 lik Agaroz Jel Çözeltisi
Agaroz 1 gr
1X TBE 50 ml. ( 450 ml distile su + 50 ml 10X TBE) EtBr 2 µl
2.1.3.3. Poliakrilamid Jel Elektroforez Tamponları 1. %40’lık Poliakrilamid Çözeltisi
Akrilamid 38 gr.
BIS 2 gr. (N,N methylene bis acrylamide) Distile su 60 ml
Toplam 100 ml. olacak şekilde hazırlandı. Saklandığı cam şişe ışık almayacak şekilde alüminyum folyo ile sarıldı ve +4°C’de saklandı.
2. %10’luk APS (Amonyum Persülfat) Çözeltisi
APS 1 gr. Distile su 10 ml. Hazırlanan çözelti +4°C’de saklandı.
40 3. Jelin İçeriği Üre 25 gr. Poliakrilamid (%40) 10.5 ml. 10X TBE 6 ml. Distile su 25 ml. APS (%10) 500 µl TEMED 30 µl 4. Yapışkan solüsyon % 95 ethanol 990 µl
Yapışkan solüsyon 5 µl (δ-methacryloxypropyltri-methoxylane) Glasiyel asetik asid 5 µl
5. dNTP karışımı
1 ml’de 2,5 mmol olacak şekilde hazırlandı. Herbir dNTP’den 25 µl olacak şekilde alındı ve 900 µl distile suyla karıştırılarak 1000 µl’lik bir karışım hazırlandı.
6. Formamidli yükleme boyası (Stop dye)
% 95 Formamid 940 µl 0,5 M EDTA 40 µl % 0,05 Bromfenol blue 10 µl % 0,05 Xylene siyanol 10 µl Toplam volüm 1ml olacak şekilde hazırlandı.
2.1.3.4. Gümüş Boyama Çözeltileri 1. %10 luk Asetik asid çözeltisi
100 ml glasiyel asetik asit. 900 ml deiyonize su
41
2. Gümüş nitrat çözeltisi
1,8 gr gümüş nitrat (AgNO3)
1500 ml deiyonize su
Karışım hazırlanarak kullanılmadan hemen önce içine 2 ml formaldehit eklendi. Bu işlemler manyetik karıştırıcı üzerinde yapıldı.
3. Sodyum karbonat çözeltisi
30 gr Sodyum karbonat (NaCO3)
2 ml Formaldehit 1 parça Sodyum tiyosülfat 1 lt. Distile su
1000 ml distile su içine 30 gr sodyum karbonat ilave edildikten sonra manyetik karıştırıcı üzerinde tamamen çözünmesi sağlandı. Çözelti soğuması için buzdolabına kaldırıldı. Kullanılmasına birkaç dakika kala içerisine 2 ml formaldehit ve 1 parça sodyum tiyosülfat eklendi. Soğuk olan çözelti bantların daha uzun zamanda görünür hale gelmesini sağlayarak işlemlerin daha kontrollü ilerlemesine yardımcı oldu.
42