3.7.1 Obtenção e Manutenção dos Animais Para Ensaio Antitumoral Contra
Sarcoma 180
Os testes para avaliação da atividade antitumoral contra Sarcoma 180 in vivo foram realizados utilizando camundongos (Mus musculus Swiss) machos, pesando entre 25-30 g oriundos do Biotério Central da Universidade Federal do Ceará, mantidos com água e alimento ad libitum. O manejo dos animais foi realizado de acordo com todos os princípios éticos, de forma a amenizar ao máximo o sofrimento dos animais. O tumor sólido do tipo Sarcoma 180, com 10 dias de implante na forma ascítica foi utilizado para determinar a atividade antitumoral do extrato acetônico das folhas de A. muricata.
O animal de manutenção ou doador foi anestesiado com éter etílico e sacrificado por meio de deslocamento cervical. Fez-se o procedimento asséptico com álcool iodado e, em seguida, coletou-se o líquido ascítico da cavidade abdominal, preparando-se uma suspensão de células com 4,3 mL de Ringer lactato, 0,2 mL de gentamicina (5 mg/mL) e 0,5 mL do líquido ascítico, para posterior contagem das células. Os animais receptores foram inoculados com 2,0 x 106 células/0,5 mL na região intraperitoneal dos camundongos (Mus
musculus Swiss).
3.7.2 Avaliação do Efeito do AMFA em Camundongos Transplantados com
Sarcoma 180
A avaliação da atividade antitumoral está relacionada à regressão total de tumores nos animais, à redução no crescimento dos tumores sensíveis ao composto ou ao aumento da expectativa de vida durante o tratamento, comparado com os não-tratados. Ficou demonstrado que o melhor resultado desses fatores depende do procedimento do tratamento, que deverá ser começado até 48 horas após o transplante. Neste período, as células tumorais já teriam iniciado a formação do nódulo tumoral (SCHABEL et al., 1977). O tumor utilizado foi o Sarcoma 180, o qual foi descoberto em 1914 no Crocker Laboratory (Columbia Univrsity, New York). É originalmente um tumor sólido, surgido espontaneamente na região axilar de camundongos, e foi inicialmente classificado como carcinoma mamário. Após vários transplantes subcutâneos, assumiu a forma sarcomatosa, por volta de 1919, e mantêm-se sem alterações até os dias de hoje (FERREIRA, 2006).
3.7.2.1 Procedimento Experimental
Para o teste de atividade antitumoral, foi utilizado o tumor sólido do tipo Sarcoma 180, com oito dias de implantação na região axilar direita. O animal doador, ou da manutenção, foi sacrificado por deslocamento cervical, sendo realizada assepsia com álcool iodado. Em seguida, foi retirado o líquido ascítico da cavidade abdominal, tendo sido preparado uma suspensão de células com 4,3 mL de Ringer lactato, 0,2 mL de gentamicina (5 mg/mL) e 0,5 mL do líquido ascítico, para posterior contagem de células. Nos animais receptores, foram injetadas 2 x 106 céls/0,5 mL na região axilar esquerda dos camundongos
(Mus musculus Swiss). Nesse experimento, foram utilizados 10 animais por grupos, num total de quatro grupos, sendo todos machos, apresentando massa corpórea variando entre 25-30 g, os quais foram inoculados com tumor Sarcoma 180. Em seguida, 24 horas após a inoculação do tumor foi iniciado o tratamento durante sete dias consecutivos, utilizando as doses de 25 e 50 mg/Kg para o AMFA e no controle positivo 25 mg/Kg de Ciclofosfamida, além dos animais tratados com veiculo (Tween 80 0,4%). Todos os grupos foram tratados por via oral, exceto o controle positivo, que foi usada a via intraperitoneal. Vinte quatro horas após o término do tratamento, os animais foram sacrificados, sendo em seguida retirados os tumores, rins, fígado e baço para pesagem e análise histológica.
O percentual de inibição do crescimento tumoral (IT) foi calculado pela fórmula: IT (%) = [(A-B)/A] x 100
Onde:
A = média dos pesos dos tumores no grupo controle. B = média dos pesos dos tumores nos animais tratados.
3.7.2.2
Análise Estatística
Os dados foram analisados a partir da média e do erro padrão da média de quatro experimentos. Os dados foram avaliados utilizando o método estatístico de Análise de Variância (ANOVA) seguida do teste Student Newman-Keuls, com o auxílio do programa Prism 5.0. Para todos os grupos considerou-se estatisticamente significativo p<0,05.
3.7.3 Obtenção e Manutenção dos Animais Para Ensaio Contra Carcinossarcoma
de Walker 256
Os testes para avaliação da atividade antitumoral contra Carcinossarcoma de Walker 256 in vivo foram realizados utilizando ratos (Ratus novergicus Wistar) machos, pesando entre 85-100 g oriundos do Biotério Central da Universidade Federal do Ceará, mantidos com água e alimento ad libitum. O manejo dos animais foi realizado de acordo com todos os princípios éticos, de forma a amenizar ao máximo o sofrimento dos animais. O tumor sólido do tipo Carcinossarcoma de Walker 256, com 8-10 dias de implante na forma sólida foi utilizado para determinar a atividade antitumoral do extrato acetônico das folhas de A.
muricata.
O rato doador ou de manutenção foi sacrificado por deslocamento cervical e a assepsia da região tumoral foi feita com álcool iodado. Em seguida, foram realizadas incisões da epiderme do animal e posterior retirada do tumor como auxílio de pinça e tesoura. O tumor foi colocado em uma placa de Petri contendo solução de Ringer-lactato com 1% de gentamicina. Após a retirada das partes necrosadas, foram selecionados fragmentos tumorais de aproximadamente 2-3 mm de diâmetro, sendo estes transferidos para outra placa de Petri contendo a mesma solução. Os fragmentos tumorais foram triturados com tesoura, peneirados e a suspensão restante foi submetida ao teste de viabilidade celular por azul de tripan e colocado em câmara de Neubauer para avaliar a viabilidade celular e fazer a contagem celular. A suspensão foi diluída para a concentração de 1,0 x 106 células tumorais/ mL e inoculado 1 mL por via subcutânea em ratos Wistar.
Após 10 dias de evolução, o tumor foi retirado dos animais doadores e o procedimento acima referido foi repetido.
3.7.3.1
Procedimento Experimental
Quatro grupos de ratos Wistar foram inoculados com 1,0 x106 células tumorais por
via subcutânea na região axilar. Vinte e quatro horas após a inoculação das células, os animais foram tratados com 25 e 50 mg/Kg de AMFA, 25 mg/Kg de Ciclofosfamida (controle positivo) e Tween 80 0,4% (controle negativo), respectivamente durante sete dias consecutivos por via oral, exceto o controle positivo, que foi usada a via intraperitoneal. Oito dias após o início do tratamento, os animais foram sacrificados para a pesagem do tumor, fígado, rins e braço.
O percentual de inibição do crescimento tumoral foi feito de acordo com a mesma fórmula descrita para o Sarcoma 180.
3.7.3.2
Análise Estatística
Os dados foram avaliados utilizando o método estatístico de Análise de Variância (ANOVA) seguida do teste Student Newman-Keuls, com o auxílio do programa Prism 5.0. Para todos os grupos considerou-se estatisticamente significativo p<0,05.