cDNA sentezi

cDNA-AFLP yönteminde kalıp molekül olarak kullanılan cDNA’lar izole edilen mRNA’lar kullanılarak sentezlenmiştir. RNA’dan sentezlenen her bir DNA iplikçiği, kalıp olarak kullanılan mRNA’nın karşı iplikçiği özelliğinde olması nedeniyle bu DNA’lara tamamlayıcı DNA (complementer DNA) anlamına gelen cDNA denilmektedir. cDNA sentezi için RevertAid^TM H minus First Strand cDNA Synthesis Kiti (Fermentas) kullanılmış ve üretici firmanın tanımladığı aşağıda verilen yönteme göre yapılmıştır:

1. Aşağıda verilen reaksiyon karışımı, cDNA sentezlemek için, buz üzerinde hazırlanmıştır. Ardından pipetle karıştırılmış ve reaksiyonları toplamak için 3-5 saniye santrifüj edilmişlerdir.

poly(A) + RNA 10 μl

oligo(dT)18 primer (0,5μg/μl) 1μl

2. Reaksiyonlar 70°C de 5 dk bekletildikten sonra buz üzerinde soğutulmuştur.

Damlaları toplamak için 3-5 saniye santrifüj edildikten sonra tekrar buz üzerine konulmuştur.

3. Yukarıda hazırlanan karışım üzerine aşağıda verilen reaksiyon bileşenleri eklenip karıştırıldıktan sonra 3-5 saniye santrifüj ile tekrar toplanmıştır.

5x reaksiyon tamponu 4μl

RiboLock™ Ribonuclease Inhibitor (20u/μl) 1μl

10mM dNTP karışımı 2μl

4. Reaksiyonlar 37°C’de 5 dk tutulduktan sonra üzerlerine 2μl M -MuLV revers transkriptaz (20u/μl) enzimi eklenmiştir.

5. Reaksiyonlar sırasıyla 70°C’de 10 dk daha tutularak durdurulmuştur.

cDNA birinci ipliğinin sentezinin ardından, birinci ipliğin tamamlayıcısı olan ikinci ipliğin sentezi RNase H (Fermentas) ve DNA Polymerase I (Fermentas) enzimleri kullanılarak üretici firmanın tanımladığı aşağıda verilen yönteme göre yapılmıştır:

21

10× DNA Polymerase I reaksiyon tamponu 8 μl

Su 68,8 μl

RNase H (E.coli) 0,2 μl (1 u)

DNA Polymerase I (E.coli) 3 μl (30 u)

1. Hazırlanan reaksiyon karışımı yavaşça pipetle karıştırıldıktan sonra 15°C’de 2 saat tutulmuştur.

2. Reaksiyonlar 5 μl 0,5 M EDTA (pH 8,0) eklenerek durdurulmuştur.

Bu şekilde cDNA-AFLP analizleri için çift sarmallı cDNA’lar elde edilmiştir. cDNA’

ların konsantrasyonları florometre ile belirlenmiştir.

3.2.5. cDNA-AFLP (Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizmi) analizleri

cDNA-AFLP analizleri Bachem ve ark. (1996) ve Breyne ve ark. (2002) göre yapılmıştır. cDNA-AFLP protokolü AFLP protokolünde olduğu gibi farklı aşamalardan oluşmaktadır. Vos ve ark. (1995) tarafından geliştirilmiş olan AFLP analizi enzim kesimi, adaptör bağlanması, ön çoğaltım ve seçici çoğaltım aşamaları dikkate alınarak dört basamakta gerçekleştirilmiştir. Ancak cDNA-AFLP yönteminde kalıp DNA olarak genomik DNA değil cDNA kullanılmıştır.

3.2.5.1. cDNA’ların restriksiyon enzimleri (MseI ve XapI) ile kesilmesi

Çift iplikli cDNA, XapI ve MseI (New England Biolabs, Ipswich, ABD) restriksiyon endonükleazları ile üretici firmanın aşağıda verilen yöntemine göre kesilmiştir. DNA üzerinde; MseI enzimi dört bazda bir, XapI enzimi ise altı bazda bir kesim yapmaktadır.

5X Reaksiyon tampon çözeltisi 5 µl XapI enzimi (10 u/ µl) 0,25 µl MseI enzimi (10 u/ µl) 0,25 µl

H2O 7,50 µl

cDNA (200-250 ng) 12 µl

Toplam 25 µl

22

Reaksiyonlar, cDNA’ların kesilmesi için 37^oC’de 3 saat süre ile bekletilmişlerdir. Daha sonra 70^oC’de 15 dk tutularak restriksiyon enzimleri inaktif edilmiştir.

3.2.5.2. Adaptörlerin bağlanması

Restriksiyon endonükleazları ile kesilmiş olan çift iplikli cDNA molekülüne adaptörlerin bağlanması ligasyon reaksiyonu ile gerçekleşmektedir. Adaptörler ikili sarmal olarak hazırlanan ve DNA dizilimleri bilinen yapay oligonükleotidler olup XapI ve MseI enzimlerin kesim sekanslarını içermektedir. Kesilen DNA parçacıklarına adaptörler 20^oC de 3 saat sürede tutularak bağlanmışlardır.

Adaptörleri bağlanması için kullanılan reaksiyonun bileşenleri aşağıdaki gibidir:

Adaptör bağlama solüsyonu 24 µl (0.5 µM XapI ve 5 µM MseI adaptör)

T4 DNA ligase (10 u/ µl) 1 µl Kesilmiş cDNA parçaları 25 µl

Toplam 50 µl

3.2.5.3. Ön seçici çoğaltması

Ligasyon reaksiyonunun ardından, ön seçici çoğaltım (pre-amplification) işlemi PCR ile gerçekleştirilmiştir. Ön seçici çoğaltım reaksiyonunda kullanılan PCR reaksiyonun bileşenleri aşağıdaki gibidir.

Kesilmiş ve adaptör eklenmiş cDNA 10 µl (10 kez seyreltilmiş)

10X PCR tamponu 5 µl

MgCl2 (25mM) 5 µl

dNTPs (2mM) 2 µl

P1 primer (10pmoles/µl) 1 µl P2 primer (10pmoles/µl) 1 µl Taq DNA polymerase (5U/µl) 0,5 µl

H2O 22,5 µl

Ön çoğaltım için PCR aşağıdaki sıcaklık ve süreler takip edilerek gerçekleştirilir:

23

1- 94^oC 4 dk 2- 94^oC 30 sn 3- 52^oC 30 sn 4- 72^oC 1 dk 2 ile 4 arası basamaklar arası 20 döngü

5- 72^oC 7 dk 6- 4^oC ∞ 3.2.5.4. Seçici çoğaltma

Ön seçici çoğaltmada elde edilen PCR ürünleri 1/50 oranında TE (Tris-EDTA) tamponu içerisinde seyreltildikten sonra tekrar PCR cihazında seçici çoğaltma işlemlerine tabi tutulmuştur. Bu aşamada XapI primerlerine 2 seçici nukleotid (XapI+2) ve MseI primerlerine ise 2 ya da 3 seçici nükleotid (MseI+2 veya MseI+3) eklenmiştir. Seçici çoğaltmada kullanılan primerlerin kombinasyonları, PCR reaksiyonunun bileşenleri ve PCR döngü protokolleri aşağıda verilmiştir.

Çizelge 3.2. Seçici çoğaltmada kullanılan primer kombinasyonları

No Primer Kombinasyonları Primer Kombinasyonları 1- XabICC- MseICAT 11- XabITT- MseICCT

Seçici çoğaltmada kullanılan PCR reaksiyonunun bileşenleri:

DNA 1µl

10X PCR tamponu 1µl

MgCl2 (25mM) 1µl

dNTPs (2mM) 1µl

Xap-sel primeri (7pmoles/µl) 1µl Mse-sel primeri (7pmoles/µl) 1µl Taq DNA polymerase (5U/µl) 0,5µl

H₂O 3,5µl

Toplam 10µl

24

Seçici çoğaltmada kullanılan PCR reaksiyonun sıcaklık döngüsü:

1- 94^oC 5 dk 2- 94^oC 30 sn 3- 65^oC 30 sn 4- 72^oC 1 dk

2 ile 4 arası basamakları 10 kere tekrarla ve 3. basamakta her döngüde sıcaklığı 0,7^oC azalt

5- 94^oC 30 sn 6- 56^oC 30 sn 7- 72^oC 1 dk 5 ile 7 arası basamakları 24 kere tekrarla

8- 72^oC 7 dk 9- 4^oC ∞

Seçici olarak çoğaltılan reaksiyonlar, eşit miktarda yükleme tamponu (10 ml Formamid, 10 mg bromfenol mavisi, 200 µl 0,5 M EDTA) ile karıştırılmıştır. Reaksiyonlar 90^oC’de 3 dk tutularak DNA parçacıkları denature edilmiş ve hemen buz üzerinde soğutulmuşlardır. Denature edilen ve soğutulan reaksiyonlardan 5 µl alıp, 30 dk ön ısıtma yapılan % 6’lık poliakrilamid jel elektroforezinde 60 W güçle 2 saat 30 dakika süre ile ayrıştırılmıştır. Büyüklüğüne göre ayrıştırılan cDNA’lara ait bantların görüntülenmesi için gümüş nitrat (AgNO3) ile boyama yöntemi kullanılmıştır. Boyama işlemi Silver Sequence DNA Sequencing System protokolüne (Promega, ABD) göre yapılmış ve fotoğraflanmıştır.

3.2.6. Farklılık gösteren bantların belirlenmesi

cDNA bantlarının gümüş boyama yöntemi ile görüntülenmesinin ardından, sarımsak genotiplerine ait 4^oC ve 20^oC’de depolanan örnekler arasında farklı ifade olan bantlar poliakrilamid jel üzerinde belirlenmiştir. Daha sonra gen ifade farklılığı sonucu oluştuğu öngörülen bantlar numaralandırılarak işaretlenmiştir.

3.2.7. cDNA-AFLP bantının nükleotid dizi analizi (sekanslama)

cDNA-AFLP bantının dizi analizi cDNA-AFLP analizleri gibi birçok aşamadan oluşmaktadır. Bu aşamalar aşağıda belirtilmiştir. Bunlarda;

25

1. cDNA-AFLP bantının poliakrilamid jelden kesilmesi ve izole edilmesi,

2. Poliakrilamid jelden izole edilmiş cDNA-AFLP bantının agaroz jelden izole edilmesi, 3. Dizi analizi için PCR aşaması ve

4. PCR ürününün saflaştırılması ve DNA dizi analizidir.

3.2.7.1. cDNA-AFLP bantının poliakrilamid jelden kesilmesi ve izole edilmesi

Polimorfik bantlardan biri, dizi analizleri için poliakrilamid jelden keskin bir bisturi yardımıyla kesilmiştir. Kesme işlemi beyaz ışık veren negateskop cihazı üzerinde gerçekleştirilmiştir. Kesilen bant, içinde 75 µl TE (Tris-EDTA) çözeltisi bulunan 1,5 ml tüp içinde bir gece buzdolabında 4^oC’de bekletilmiştir. Bekleme işleminden sonra, kesilen cDNA-AFLP bantı pipet ucu ile iyice parçalanmıştır. Daha sonra bu tüp mikrosantrifüj cihazında 1 dk kadar döndürülerek jel parçalarının ve diğer kimyasalların tüp dibinde çökelmesi ve DNA’nın ise çözelti içinde kalması sağlanmıştır. Elde edilen örnek daha sonraki aşamalar için –20^oC’de muhafaza edilmiştir.

3.2.7.2. Poliakrilamid jelden izole edilmiş cDNA-AFLP bantının agaroz jelden izole edilmesi

Poliakrilamid jelinden izole edilen cDNA-AFLP bantı PCR ile çoğaltılmış ve tekrar agaroz jelden izole edilmiştir. Bu şekilde cDNA-AFLP bantı dizi analizleri için saflaştırılmıştır. cDNA-AFLP bantının çoğaltılması için kullanılan PCR reaksiyonu ve PCR döngüsü aşağıdaki gibidir.

26

PCR cihazında çoğaltılan bant, % 2 konsantrasyonundaki agaroz jelde ayrıştırılmıştır.

Bant, agaroz jelden keskin bir bisturi ile kesilmiştir. Kesilen bantın agaroz jelden izolasyonunda “EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction kiti (BioBasic, Kanada)”

kullanılmıştır.

3.2.7.3. Dizi analizi için PCR aşaması

Dizi analizi için PCR aşaması ve diğer aşamalar Amerika Birleşik Devletleri-Wisconsin Üniversitesi’ndeki Prof. Dr. P. W. Simon’un laboratuarında gerçekleştirilmiştir. Dizi analizi için PCR reaksiyonları bir bant için iki taraflı olarak (geri ve ileri primerleri için ayrı reaksiyonlar) yapılmıştır. Bu şekilde bir bant için iki defa dizi analizi yapılmıştır.

Dizi analizi için yapılan PCR bileşenleri ve döngüsü aşağıda verilmiştir.

PCR bileşenleri:

27

3.2.7.4. PCR ürününün saflaştırılması ve DNA dizi analizi

Dizi analizi için elde edilen PCR ürünün saflaştırılması “Agencourt CleanSEQ kiti (Beckman Coulter, CA, ABD)” kullanılarak yapılmıştır. Sekans analizleri Wisconsin Üniversitesi, Madison, WI, ABD’de bulunan sekanslama makinalarında yapılmıştır.

Elde edilen bulgular Gen Bankası’ndaki DNA dizilimi veri tabanı ile karşılaştırılmıştır.

3.2.8. Morfolojik ölçümlerin istatiksel analizleri

Deneme, ‘Tesadüf Parselleri’ deneme desenine göre 3 tekrarlamalı olarak yürütülmüştür. Uygulamalar arasındaki farklılık ‘Duncan’ testi ile 0,05 önem seviyesinde ortaya konulmuştur.

28

4- BULGULAR

4.1. Morfolojik Gözlemler

İki adet çiçeklenen (G1, G2) ve iki adet çiçeklenmeyen (G3, G4) dört farklı sarımsak genotipi dikim öncesi depolama sıcaklıklarının bitki gelişimi üzerine etkisini belirlemek amacıyla kullanılmıştır. 4^oC’de ve 20^oC’de d ep olanan G1 , G2 , G3 ve G4 sarımsak genotiplerinin dişlerinden gelişen bitkiler arasındaki morfolojik farklılıklar gözlemlenmiştir. Bu bitkilere ait yaprak sayısı, yalancı gövde uzunluğu ve yalancı gövde çapı dikimden kırk beş gün (6 Ocak 2010) ve dikimden doksan gün (22 Şubat 2010) sonra ölçülmüştür.

Yapılan morfolojik gözlemlere göre, sarımsak dişleri saksılara dikildikten sonra, 4^oC’de depolanan sarımsak dişlerinin 20^oC’de depolanan sarımsak dişlerine göre daha önce sürdüğü belirlenmiştir (Çizelge 4.1, Şekil 4.1). Özellikle çiçeklenmeyen G3 genotipinde, 20^oC’de depolanan dişler 4^oC’de depolananlardan yirmi altı gün sonra sürdüğü görülmüştür.

Çizelge 4.1. Dikim tarihinden itibaren sarımsak dişlerinin sürme tarihleri

Genotipler

Bitkilerin dikim zamanı

Bitkilerin sürme zamanı 4^oC 20^oC G1 23.11.2009 30.11.2009 07.12.2009 G2 23.11.2009 02.12.2009 06.12.2009 G3 23.11.2009 06.12.2009 01.01.2010 G4 23.11.2009 30.11.2009 05.12.2009

29

Şekil 4.1. Dikimden yirmi üç gün sonra G3 genotipi için; 20^oC'de depolanan dişler henüz sürmemişken, 4^oC depolanan dişlerden elde edilen bitki iki yaprak aşamasına gelmiştir

Yine dikimden yirmi üç gün sonra yapılan gözlemlere göre, 4^oC’de depolanan sarımsak genotiplerinin dişlerinden gelişen bitkiler, 20^oC’dekilere göre çok daha hızlı ve sağlıklı bir gelişim göstermiştir ( Şekil 4.2).

Şekil 4.2. G2 (A), G3 (B) ve G4 (C) genotiplerinde her iki uygulama için görülen gelişimsel farklılıklar

Dikimden yirmi yedi gün sonra yapılan gözlemlerde 20^oC’de depolanan sarımsak genotiplerinin dişlerinden gelişen bitkilerde büyümenin ilk aşamalarında virüs semptomuna benzeyen, düzgün olmayan yaprak gelişimi gözlenmiştir (Şekil 4.3) ve bu görünüm ilerleyen safhalarda daha da belirgin hale gelmiştir (Şekil 4.4).

30

Şekil 4.3. G1 genotipinin 4^oC ve 20^oC'de depolanan dişlerinden gelişen bitkiler

Şekil 4.4. G1 (A), G2 (B), G3 (C) ve G4 (D) genotipleri için 4^oC ve 20^oC depolanan dişlerden elde edilen bitkiler arasında gelişme yönünden farklılıklar

31

Dikimden kırk beş gün sonra, genotipe ve depolama uygulamasına göre değişmekle birlikte, bitkiler ortalama üç dört yaprak aşamasına gelmiştir. Bu dönemde, yaprak ve meristem örneği almak için sökülen bitkilerde üç yaprak aşamasından sonra dişteki besin maddelerinin tamamen tüketildiği görülmüştür (Şekil 4.5).

Şekil 4.5. A) G4 genotipi, sökülen düşük sıcaklık ve oda sıcaklığı uygulanmış bitkiler B) Düşük sıcaklık uygulaması C) Oda sıcaklığı uygulaması

Dikimden yüz on beş gün sonra, çiçeklenen bir genotip olan G1 ile çiçeklenmeyen bir genotip olan G4’ten sökülen bitkilerde, 4^oC’de ve 20^oC’de depolanan sarımsak genotiplerinin dişlerinden gelişen bitkiler arasındaki karşılaştırma ve sayısal veriler Çizelge 4.2’de verilmiştir. Ayrıca dikimden yüz yirmi gün sonra, çiçeklenen bir genotip olan G2 ile çiçeklenmeyen bir genotip olan G3’ten sökülen bitkilerde, 4^oC’de ve 20^oC’de depolanan sarımsak genotiplerinin dişlerinden gelişen bitkiler arasındaki karşılaştırma ve sayısal veriler aynı çizelgede yer almaktadır.

32

Çizelge 4.2. Dikimden yüz on beş ve yüz yirmi gün sonra G1, G2, G3 ve G4’te her iki sıcaklık uygulaması için bitkiler arasındaki karşılaştırma

Dikimden 115 gün sonra Dikimden 120 gün sonra G1 sürgününün büyümeye başladığı gözlenirken 20^oC'de depolanan dişlerden elde edilen bitkilerde henüz başlamadığı saptanmıştır. Ayrıca düşük sıcaklıkta depolanan dişlerden elde edilen bitkilerde dişlerin oluştuğu ve dolayısıyla baş oluşumunun başladığı tespit edilmiştir (Şekil 4.6). 20^oC’de depolanan dişlerden elde edilen bitkilerde böyle bir durum gözlenmemiştir. Dikimden yüz yirmi gün sonra, yapılan gözlemlere göre de G1 genotipine benzer şekilde G2 genotipinin 4^oC'de depolanan dişlerinden gelişen bitkilerinde hem çiçek sapı gelişimi hem de başta diş gelişiminin başladığı, 20^oC'de depolanan dişlerden gelişen bitkilerde ise henüz bu özelliklerin gelişmeye başlamadığı gözlemlenmiştir. G3 ve G4 çiçeklenme özelliği olmayan klonlar olduğu için bu genotiplerin her iki depo sıcaklığı uygulamasında da çiçeklenme görülmemiş ancak bu genotiplerde diş oluşumunun sadece 4^oC'de depolanan dişlerden gelişen bitkilerde başladığı belirlenmiştir.

33

Şekil 4.6. A) G1 genotipinde her iki sıcaklık uygulaması için baş oluşumunu karşılaştırma B) +20^oC’de depolanan dişlerden gelişen bitki C) +4^oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkide baş oluşumu

4^oC depolanan dişlerden gelişen bitkiler ile 20^oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkiler arasında kök gelişimi bakımından da farklılık söz konusudur (Şekil 4.7). 4^oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkilerde kök gelişiminin çok daha iyi olduğu görülmüştür.

34

Şekil 4.7. G1 (A), G2 (B), G3 (C) ve G4 (D) için 4^oC ve 20^oC depolanan dişlerden elde edilen bitkiler arasında kök gelişimi yönünden farklılıklar

4.1.1. Yaprak sayısı

Bütün genotiplerde; 4^oC’de üç ay süre ile depolanan dişlerden gelişen bitkilerin ortalama yaprak sayısı, 20^oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkilerin ortalama yaprak sayısından daha fazla olduğu saptanmıştır. Genotipler arasındaki farklılık ‘Duncan’ testi ile 0,05 önem seviyesinde SPSS 17.0 bilgisayar programı kullanılarak ortaya konulmuştur. Duncan testine göre yapılan analizlerde, dikimden kırk beş gün (6 Ocak 2010) ve dikimden doksan gün (22 Şubat 2010) sonra yapılan yaprak sayımında, 4^oC’de

35

ve 20^oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkilerde yaprak sayısı bakımından genotipler arasında istatistiki olarak fark görülmüştür (Şekil 4.8, Çizelge 4.3).

Şekil 4.8. Dikim öncesi depolama sıcaklığına bağlı olarak, dikimden kırk beş gün (06.01.2010) ve dikimden doksan gün sonra (22.02.2010) sarımsak genotiplerinin ürettiği yaprak sayılarının karşılaştırılması

Çizelge 4.3. Dikimden kırk beş gün ve dikimden doksan gün sonra 4^oC’de ve 20^oC’de depolanan dişlerden elde edilen bitkilerde yaprak sayımındaki farklılıklar

Genotip

Dikimden kırk beş gün sonra

Dikimden doksan gün sonra 4°C 20°C 4°C 20°C G1 4,44^d 3,22^c 7,11 ^c 5,78^d G2 3,33^b 2,33^b 5,89 ^b 4,61^c G3 2,78^a 1,11^a 4,33 ^a 3,00^a G4 3,89^c 2,56^b 5,83 ^b 4,17^b

36

Dikimden kırk beş gün ve dikimden doksan gün sonraki ölçümlerde, 4^oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkiler 20^oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkilerden en az bir adet fazla yaprak ürettiği gözlemlenmiştir. Örneğin G4 genotipi için; dikimden kırk beş gün sonra yapılan ölçümde 4^oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkilerde ortalama yaprak sayısı 3,89 olurken aynı genotipin 20^oC’de depolanan dişlerinden gelişen bitkilerinde yaprak sayısı 2,56’da kalmıştır. Dikimden doksan gün sonraki ölçümlerde ise 4^oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkilerde ortalama yaprak sayısı 5,83 ve 20^oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkilerde ise ortalama yaprak sayısı 4,17 olmuştur (bkz.

Çizelge 4.3).

Hem dikimden kırk beş gün hem de dikimden doksan gün sonra yapılan yaprak sayımında, 4^oC ve 20^oC depolama uygulamalarının her ikisinde de en fazla ortalama yaprak sayısı G1 genotipinde en az ortalama yaprak sayısı ise G3 genotipinde olduğu görülmüştür. Dikimden kırk beş gün sonra yapılan ölçümde G1 genotipi için 4^oC'de depolanan dişlerden elde edilen bitkilerde ortalama yaprak sayısı 4,44 iken 20^oC'de depolanan dişlerden gelişen bitkilerde 3,22’de kalmıştır. Aynı şekilde dikimden doksan gün sonra, G1’de düşük sıcaklıkta depolanan dişlerden elde edilen bitkiler için ortalama yaprak sayısı 7,11 iken oda sıcaklığında depolanan dişlerden elde edilen bitkilerde ortalama yaprak sayısı 5,78’de kalmıştır. G3 genotipinde ise; dikimden kırk beş gün sonra yapılan ölçümde düşük sıcaklıkta depolanan dişlerden elde edilen bitkilerde ortalama yaprak sayısı 2,78 iken oda sıcaklığında depolanan dişlerden elde edilen bitkilerde 1,11’de kalmıştır. Dikimden doksan gün sonra, G3 genotipinde 4^oC’de depolanan dişlerden elde edilen bitkiler için ortalama yaprak sayısı 4,33 iken 20^oC’de depolanan dişlerden elde edilen bitkilerde 3,00’da kalmıştır.

Dikimden kırk beş gün sonra 20^oC uygulaması için en fazla yaprak sayısına sahip genotip olarak G1 genotipi belirlenmiştir. Buna karşın G2 ve G4 genotipleri arasında istatistiki bir fark görülmemiştir. En az yaprak sayısının ise G3 genotipinde olduğu belirlenmiştir. Buda istatistiki olarak diğerlerinden farklıdır.

Dikimden doksan gün sonra ise 4^oC uygulaması için en fazla yaprak sayısına sahip genotip olarak yine G1 genotipi belirlenmiştir. Buna karşın G2 ve G4 genotipleri

37

arasında istatistiki bir fark görülmemiştir ve sırasıyla 5,89 ve 5,83 yaprak meydana getirdiği görülmüştür. En az yaprak sayısının ise 4,33 ile G3 genotipinde olduğu belirlenmiştir ve istatistiki olarak diğerlerinden farklıdır. Dikimden doksan gün sonra 20^oC uygulaması için en fazla yaprak sayısına sahip genotip olarak yine G1 genotipi belirlenmiştir ve ortalama 5,78 yaprak sayısına sahip olmuştur. Yine G2 ve G4 genotipleri sırasıyla 4,17 ve 4,61 yaprak ürettiği görülmüştür. En az yaprak sayısının ise 3,00 ile G3 genotipinde olduğu belirlenmiştir. İstatistiki olarak diğerlerinden farklıdır.

4.1.2. Yalancı gövde uzunluğu

Bütün genotiplerde; 4^oC’de üç ay süre ile depolanan dişlerden gelişen bitkilerin ortalama yalancı gövde uzunluğu, 20^oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkilerin ortalama yalancı gövde uzunluğundan daha fazla olduğu saptanmıştır. Genotipler arasındaki farklılık ‘Duncan’ testi ile 0,05 önem seviyesinde SPSS 17.0 bilgisayar programı kullanılarak ortaya konulmuştur. Duncan testine göre yapılan analizlerde, hem dikimden kırk beş gün hem de dikimden doksan gün sonra yapılan yalancı gövde uzunluğu ölçümünde, 4^oC’de ve 20^oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkilerde yalancı gövde uzunluğu bakımından genotipler arasında istatistiki olarak fark görülmüştür (Şekil 4.9, Çizelge 4.4).

38

Şekil 4.9. Dikim öncesi depolama sıcaklığına bağlı olarak, dikimden kırk beş gün (06.01.2010) ve dikimden doksan gün (22.02.2010) sonra sarımsak genotiplerinde meydana gelen yalancı gövde uzunluklarının karşılaştırılması

Çizelge 4.4. Dikimden kırk beş gün ve dikimden doksan gün sonra 4^oC’de ve 20^oC’de depolanan dişlerden elde edilen bitkilerde yalancı gövde uzunluğundaki (cm) farklılıklar

Genotip

Dikimden kırk beş gün

Dikimden doksan gün sonra 4°C 20°C 4°C 20°C G1 6,78^c 2,91^c 11,11^d 4,06^b G2 3,39^a 1,66^b 7,55^b 2,56^a G3 3,50^a 1,00^a 6,66^a 2,56^a G4 4,56^b 1,11^a 9,08^c 2,31^a

Dikimden doksan gün sonra yapılan ölçümlere bakıldığında 4^oC’de depolanan dişlerden elde edilen bitkilerin ortalama yalancı gövde uzunluklarının 20^oC’de depolananlardan

39

elde edilenlere göre çok daha fazla olduğu gözlemlenmiştir. Örneğin G4 genotipi için;

dikimden kırk beş gün sonra yapılan ölçümde 4^oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkilerde ortalama yalancı gövde uzunluğu 4,56 cm iken, aynı genotipin 20^oC’de depolanan dişlerinden gelişen bitkilerinde 1,11 cm’de kalmıştır. Dikimden doksan gün sonra yapılan ölçümlerde ise 4^oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkilerde ortalama yalancı gövde uzunluğu 9,08 cm iken, 20^oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkilerde 2,31 cm’dir.

Dikimden kırk beş ve dikimden doksan gün sonraki ölçümler karşılaştırmalı olarak incelendiğinde; dikimden doksan gün sonraki ölçümlerde ortalama yalancı gövde uzunluğunun belirgin bir şekilde daha fazla olduğu görülmektedir. Örneğin; G3 genotipinde dikimden kırk beş gün sonra, 4^oC’de depolanan dişlerden elde edilen bitkilerin ortalama yalancı gövde uzunluğu 20^oC’de depolanan dişlerden elde edilen bitkilerin ortalama yalancı gövde uzunluğudan 2,50 cm daha fazla iken bu fark dikimden doksan gün sonra 4,10 cm’ye yükselmiştir.

Dikimden kırk beş gün sonra 4^oC uygulaması için en fazla yalancı gövde uzunluğuna sahip genotip olarak G1 genotipi belirlenmiştir ve ortalama 6,78 cm’lik yalancı gövde uzunluğuna sahiptir. G4 genotipinin yalancı gövde uzunluğu 4,56 cm iken G2 ve G3 genotipleri arasında istatistiki bir fark görülmemiştir ve sırasıyla 3,39 cm ve 3,50 cm yalancı gövde uzunluğuna sahip oldukları belirlenmiştir. Dikimden kırk beş gün sonra 20^oC uygulaması için en fazla yalancı gövde uzunluğuna sahip genotip olarak yine G1 genotipi belirlenmiştir ve ortalama 2,91 cm’lik yalancı gövdeye sahip olmuştur. Hemen ardından 1,66 cm ile G2 genotipi gelmiştir. En az yalancı gövde uzunluğu ise G3 ve G4 genotiplerindedir ve bunlar arasında istatistiki bir fark görülmemiştir. G3 ve G4’ün sırasıyla 1,00 cm ve 1,11 cm’lik yalancı gövdeye sahip olduğu belirlenmiştir.

Dikimden doksan gün sonra 4^oC uygulaması için en fazla yalancı gövde uzunluğuna sahip genotip olarak yine G1 genotipi belirlenmiştir ve ortalama 11,11cm’dir. Ardından G4 ve G2 genotipleri sırasıyla 9,08 cm ve 7,55 cm’lik yalancı gövdeye sahip oldukları ölçülmüştür. En az yalancı gövde uzunluğu ise 6,66 ile G3 genotipinde olduğu belirlenmiştir ve istatistiki olarak diğerlerinden farklıdır. Dikimden doksan gün sonra

40

20^oC uygulaması için en fazla yalancı gövde uzunluğuna sahip genotip olarak yine G1 genotipi belirlenmiştir ve ortalama 4,06 cm yalancı gövde uzunluğuna sahiptir.

Ardından G2, G3 ve G4 genotipleri sırasıyla 2,56 cm, 2,56 cm ve 2,31 cm’lik yalancı

Ardından G2, G3 ve G4 genotipleri sırasıyla 2,56 cm, 2,56 cm ve 2,31 cm’lik yalancı

Belgede SARIMSAKTA (Allium sativum L.) DÜŞÜK SICAKLIKTA DEPOLAMA UYGULAMASINDAN FARKLI ETKİLENEN ADAY GENLERİN cdna- AFLP YÖNTEMİ İLE BELİRLENMESİ (sayfa 33-0)