Çalışmanın beyaz Yeni Zelanda cinsi 1200-1500gr ağırlıklı 4 aylık tavşanlar üzerinde yapılması planlanmıştır. Tavşanlar deney süresince ‘Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Deney Hayvanları Araştırma Laboratuarı Usul Ve İşleyiş Esasları’ doğrultusunda D.E.Ü. Deney Hayvanları Laboratuarı'nda bakılmıştır. Opere edilen tüm tavşanlar 4-6-8. ve 10. haftalarda aynı yöntemle anestezi uygulanarak ve kulaktaki deneye tabi tutulmuş doku örnekleri alındıktan sonra eter fanusunda sakrifiye edilmiştir.
Alınan yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyon elde edilmesi Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı Araştırma Laboratuarında yapılmıştır.
Histopatolojik çalışmalar Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı’nda yapılmıştır. Sonuçlar Student t test ile istatiksel olarak değerlendirilmiştir.
Yönteme ait ayrıntılar
1.Hipertrofik skar oluşturulması:
-Morris72 ve ark. tanımladığı şekilde, tavşan ketamin 25mg/kg + ksilazin 10mg/kg ile genel anestezi altında yatırılır.
-Kulak ön yüzünde yara yapılacak 2 nokta tespit edildikten sonra povidon iyot solüsyonu ile steril ortam oluşturulur.
-1 cm ara ile 2 adet 7 mm çapında deri eksizyonu yapılır (Resim 1-2).
-Ardından kulak kıkırdağının ön yüzdeki perikondriyumu 3x büyütme eşliğinde disseke edilerek ayrılır (Resim 3).
-Oluşan defekt okluziv örtü (Tegaderm® 3M) ile pansuman yapılarak cerrahi işleme son verilir(Resim 4).73,143,144
Resim 1. Ameliyat öncesi çizim yapıldıktan sonra her iki kulak betadin solüsyon ile temizlenerek steril ortam oluşturulur.
.
Resim 3. Perikondrium 3x büyütme altında kaldırılır.
2.Ciltaltı yağ dokusunun elde edilmesi:
-Dördüncü haftada ciltaltı yağ dokusu elde edilmesi amacı ile tavşan ketamin 25mg/kg + xylazin 10mg/kg karışımla uyutulmuştur.
-Tavşan ameliyat masasına sırt üstü yatırılarak her iki kasık bölgesi tıraş edilmiştir.
-Bölge daha sonra betadin solüsyonla temizlenerek sağ kasıktan sol kasık bölgesine kadar U şeklinde yapılan insizyonla cilt katı geçilmiştir (Resim 5-7).
-Tavşanın kasık bölgesinde bulunan ciltaltı yağ dokusunun tamamı cerrahi yolla elde edilmiştir.
Resim 6. Her iki kasık bölgesinde bulunan yağ dokusu bütün halinde greft olarak kullanılmıştır.
3.Yağ greftinin elde edilmesi:
-Genel anestezi altında tavşan inguinal bölgesinden elde edilen yağ dokusu, serum fizyolojik ile irrige edildikten sonra cerrahi makas ile 1mm3 boyutuna gelene kadar kıyılmıştır. Ardından enjektöre yerleştirilerek işleme hazır hale getirilir ve hipertrofik skar dokusunun altına 22G branül ile 0,02 ml enjekte edilmiştir (Resim 8- 12).
Resim 8. Alınan yağ grefti makas ile enjekte edilebilecek boyutlara gelene kadar kıyılmıştır.
Resim 10. Branül, iğnesi ile birlikte skar dokusunun altına yerleştirildikten sonra iğnesi çıkartılarak insülin enjektörü yerleştirilmiştir.
Resim 11. 0,02 ml yağ grefti skar dokusunun altına enjekte edilmiştir.
Resim 12. Enjeksiyondan sonraki görünüm. Yağ grefti enjekte
edilmemiş skar dokusu
Yağ grefti enjekte edilmiş skar dokusu
4.Yağ dokusundan SVF elde edilmesi DEÜ Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji Anabilim dalı Araştırma Laboratuarında aşağıdaki protokole uygun olarak gerçekleştirilmiştir:
-Yaklaşık 30 ml hacim içerisindeki yağ dokusu hayvanlardan alındıktan sonra laboratuvara steril %0,9 NaCl solüsyonu içinde getirilmiştir (Resim 13).
-Laboratuara getirilen yağ dokusu makas ile petri kabına kıyılmıştır (Resim 14). -Üzerine 20 ml amfoterisin B, penisilin ve streptomisin içeren Hanks’ Balanced
Salt Solution (HBSS) konur ve 2 dakika boyunca yağ dokusunun sıvıda askıda
kalmasına izin verilmiştir (Resim 15).
-Yağ dokusu sıvının üst fazında askıda kalıyor olmasından dolayı alttaki tüm sıvı uzaklaştırılmıştır. Bu işlem 5 kere tekrarlanarak kan ve diğer yapıları yağ dokusundan uzaklaştırılmış olunur.
-Yağ dokusu 75 mm2’lik hücre kültür kabına aktarılır. Üzerine HBSS içerisinde hazırlanmış % 0.2 kollajenaz solüsyonu eklenmiştir (Resim 16).
-37 0C de 150 dakika karıştırılarak bekletilmiştir (Resim 17). -Fetal bovin serum ile kollajenaz inaktive edilmiştir.
-5000 rpm hızında 10 dakika santrifüj yapılıp, üst sıvı atılır alttaki hücre pelleti ile çalışmaya devam edilmiştir (Resim 18)
-Hücre pelleti içerisindeki eritrositleri uzaklaştırmak için 20 ml hücre liziz tamponu eklenip ve oda sıcaklığında 10 dakika beklemeye bırakılmıştır.
-Hücre süspansiyonu önce 40 µm çapa sahip delikli yapıdan süzdürülmüştür. 50 ml'lik tüpte toplanan hücreler bu seferde 100 µm çapa sahip delikli yapıdan süzdürülmüştür. Böylelikle hücre dışındaki büyük yapılardan kurtulmuş olunur.
-5000 rpm hızında 5 dakika santrifüj yapılarak hücrelerin ayrılması sağlanmıştır. Santrifüj sonrası en üstte beyaz bulutumsu bir tabaka dikkatlice çekilip yeni bir tüpe aktarılmıştır (Resim 19).
-Bu hücre süspansiyonunun üstte kalan sıvı kısmı atıldıktan sonra tüpün tabanında bulunan pellet, mikropipet aracılığı ile hipertrofik skar dokusunun altına enjekte edilmiştir (Resim 20-22).
Resim 13. Steril %0,9 NaCl solüsyonu içerisinde laboratuara getirilen yağ dokusu.
Resim 14. Petri kabındaki yağ dokusu makas ile küçük parçalara kıyılmıştır.
Resim 15. Yirmi ml antibiyotikli HBSS solüsyonu içerisinde askıda kalan yağ dokusu.
Resim 16. Kollajenaz ile muamele edilmek üzere yağ dokusu kültür kabına yerleştirilmiştir.
Resim 17. Kollajenaz ile 150 dakika karıştırılan yağ dokusu beyaz renkli krema kıvamına gelmiştir.
Resim 18. On dakika santrifüjden sonra tabanda biriken hücre pelleti görülmektedir.