2.1. Hayvanlar ve diyetler
Çalışmada hayvan materyali olarak 2,5-3,0 kg vücut ağırlıklı, elli dişi Yeni Zelanda beyaz tavşan kullanıldı. Hayvanlar ısı, ışık ve hava kontrollü beşli kafeslerde tutuldu. Tavşanlar temin edildikten sonra 2 hafta süreyle normal diyetle (yonca otu) beslendi. Sonra, hayvanlar gruplar arası kilolar eşit olacak şekilde beş gruba ayrıldı. Bunlardan ilk ikisi (kontrol grupları), 7 ay süreyle sırasıyla düşük enerjili diyet (yonca otu) ve yüksek enerjili diyet (metabolik enerji: 2800 en az/kkal/kg, konsantre pelet yem, CP Yem 5701) ile beslendi. Diğer gruplar (deneme grupları) da aynı süre için yukarıda sözü edilen yüksek enerjili diyetle beslendi. Birinci deneme grubuna 10 mg B/kg, ikinci deneme grubuna 30 mg B/kg ve üçüncü deneme grubuna da 50 mg B/kg hesabıyla 96 saat aralıkla deneme süresince Boraks deka hidrat (Na2B4O7. 10
H2O, Eti Holding AŞ) eriyiği (% 1’lik Bor) oral gavajla (beslenme kateteri, 2 mmX(6
Ch)X470mm, Bıçakçılar®) içirildi. Benzer uygulama kontrol grubu hayvanlara su
verilerek yapıldı. Ayrıca bütün yüksek enerjili diyetle beslenen gruplarada haftada bir kez olmak üzere bir tutam yonca otu diyete ilave edildi. Diyet ve su, deneme süresince ad libidum sağlandı. Kilo kazanımı aylık olarak belirlendi.
2.2. Analizler
Kan örnekleri deneme süresince her ay alındı ve bazı biyokimyasal parametrelere aylık, bazılarına ise 2 aylık aralıklarla bakıldı. Stressiz kan almak için 5 dk önce oral asepromazin (Plegicil®, Sanofi Aventis) uygulandı. Kan heparinli, K- EDTA’lı ve antikoagulantsız tüplere (kulak santral arterden) alındı ve hematolojik analiz (kan gazları ve otomatik kan sayımı) için hemen kullanıldı. Serum ve plazma elde etmek için kan santrifüj edildi (3000 devir, 10 dk). Kısa süreli asit baz ve elektrolit dengesinin takibi için Bor verildikten 3, 24, 48 ve 72 saat sonra hematolojik analiz yapıldı. Çalışma sonunda hayvanlar sakrifiye edilerek viseral yağlanma belirlendi ve karaciğer örnekleri alınarak tartıldı. Karaciğer örnekleri her karaciğerde sol lobta aynı lokal yerden alındı. Tüm kan, serum, plazma ve karaciğer örnekleri analiz edilinceye kadar -20 C ve -80 C’de saklandı.
2.2.1. Hematolojik analiz
Heparinli venöz kan örneklerinden sulu sistem kan gazları cihazı (CHIRON 348, diagnostic) ile pH, PCO2, PO2, HCO3, BE, Na, K, Cl, anyonik gap, O2 sat
ölçüldü.
Potasyum-ETDA’lı venöz kan örneklerinden otomatik kan sayımı cihazı (Medonic, CA530) ile eritrosit, lökosit, trombosit sayıları, MCV, MCH, MCHC, PCV, Hb, RDW (a), RDW (%) ölçüldü.
2.2.2. Serum/plazma Biyokimyasal profil
İnsülin (Bıosource®) INS-EASIA (KAP:1251) ticari kiti ile -200C’de saklanmış se- rumda ELISA ile belirlendi.
Glikoz (Cromatest®) REF: 1129005 ticari kiti ile -200C’de saklanmış plazmada
(K3EDTA) spektrofotometrik olarak belirlendi.
Total-kolesetrol (Cromatest®) REF: 1118005 ticari kiti ile -200C’de saklanmış plaz-
mada (K3EDTA) spektrofotometrik olarak belirlendi.
Lipoprotein (Cromatest®) REF: 1133010 ticari kiti ile -200C’de saklanmış plazmada
(K3EDTA) spektrofotometrik olarak belirlendi.
Total protein (Cromatest®) REF: 1153005 ticari kiti ile -200C’de saklanmış plazmada
(K3EDTA) spektrofotometrik olarak belirlendi.
Albümin (Cromatest®) REF: 1101000 ticari kiti ile -200C’de saklanmış plazmada
(K3EDTA) spektrofotometrik olarak belirlendi.
NEFA (serbest yağ asitleri) (Randox Catalog Number FA 115 30t) ticari kiti ile -
700C’de saklanmış plazmada (K3EDTA) spektrofotometrik olarak belirlendi.
Trigliserid (Cromatest®) REF: 1155005 ticari kiti ile -200C’de saklanmış plazmada
(K3EDTA) spektrofotometrik olarak belirlendi.
Mineraller Ca, Mg ve P (spektrofotometrik olarak); Na, K ve Cl (kan gazları cihazı ile)
Na, K, Cl (Heparinli venöz kan örneklerinden sulu sistem kan gazları cihazı (CHİRON 348, diagnostic)
Ca (Cromatest®) REF: 1115000 ticari kiti ile -200C’de saklanmış plazmada (Lityum Heparin) spektrofotometrik olarak belirlendi.
Mg (Cromatest®) REF: 1144005 ticari kiti ile -200C’de saklanmış plazmada (Lityum Heparin) spektrofotometrik olarak belirlendi.
P (Cromatest®) REF: 1149005 ticari kiti ile -200C’de saklanmış plazmada
(Lityum Heparin) spektrofotometrik olarak belirlendi. Se ICP AES metodu ile belirlendi.
Enzimler
AST (Cromatest®) REF: 1109000 ticari kiti ile -200C’de saklanmış serumda spektrofotometrik olarak belirlendi.
ALT (Cromatest®) REF: 1105000 ticari kiti ile -200C’de saklanmış serumda spektrofotometrik olarak belirlendi.
GGT (Cromatest®) REF: 1126005 ticari kiti ile -200C’de saklanmış serumda spektrofotometrik olarak belirlendi.
Vitamin-C -200C’de saklanmış plazmada (Lityum Heparin) modifiye edilerek
spektrofotometrik olarak belirlendi.
Seruloplazmin -200C’de saklanmış plazmada (Lityum Heparin) modifiye edilerek
spektrofotometrik olarak belirlendi.
2.2.3. Karaciğer biyokimyasal analizi
Triacylglycerol (TAG), (Cromatest®) REF: 1155005 ticari kiti ile modifiye edilerek
1gr karaciğerde spektrofotometrik olarak belirlendi.
Total protein (Cromatest®) REF: 1153005 ticari kiti ile modifiye edilerek 1gr karaciğerde spektrofotometrik olarak belirlendi.
Lipid peroksidasyon (OxisResearchTM BIOXYTECH®LPO-586TM Catalog Number
21012) ticari kiti ile 1gr karaciğerde spektrofotometrik olarak belirlendi.
Glutasyon (OxisResearchTM BIOXYTECH®GSH-420TM Catalog Number 21023) ti-
cari kiti ile 1gr karaciğerde spektrofotometrik olarak belirlendi.
Katalaz (OxisResearchTM BIOXYTECH®GSH-520TM Catalog Number 21042) ticari
Selenyum miktarı ICP AES metodu ile belirlendi.
2.2.4. Karaciğer histolojik ve histokimyasal analizi
Karaciğer numuneleri, formol-kalsiyum tespit solüsyonunda +4o
C de 16 saat bekletildi. Kryostatta 12µ kalınlığında alınan doku kesitleri Sudan Black boyası ile boyandı. Kare mikrometre (10x10) kullanılarak her preparatta 5 (beş) doku alanı değerlendirildi. Sonuçta karaciğer epitel hücreleri sitoplazmasındaki yağlanma, µm2/100 µm2
cinsinden ışık mikroskobunda 1000’lik büyütme kullanılarak ölçüldü ve karaciğer yağlanma yüzdesi belirlendi.
2.2.5. Nükleer manyetik rezonans (NMR) analizi
Bir ve iki boyutlu Bruker Biospin NMR cihazı (600 MHz, Wageningen Üni- versitesi, Nükleer Manyetik Rezonans Merkezi, Wageningen, Hollanda) kullanıldı (Resim 2.2.5.1) ve 1H, 31P ve 11B NMR analizleri yapıldı. Bunun için ependorf tüpler 13,000g +4C’de 4 dakika santrifüje edildi. Her bir örnek için 550 µl alınıp 5mm’lik
NMR tüpüne kondu, üzerine 500 µl deuterium oksit (D2O) ilave edildi (Serkova ve
ark 2006) ve adı geçen cihazda otomatik olarak okundu. Belirlenen metabolomikler şunlardır: Formik asit, tirozin, histidin, alfa-glikoz, beta-glikoz, laktik asit, kreatin, sitrat, glutamin, pirüvik asit, metiyonin, asetik asit, alanin, hidroksibütrik asit, valin ve lipidler.
Resim 2.2.5.1. Bruker biosipin NMR cihazı (600 MHz).
2.2.6. Bor Analizi
Serum, tam kan, karaciğer, yem, su ve dışkıda Bor analizleri Referans Mater- yal 8414 (National Institut of Standarts and Technology) kullanılarak ICP-AES (VARIAN VISTA AX CCD) metoduyla Selçuk Üniversitesi Ziraat Fakültesi Analiz Labaratuarında belirlendi.
2.2.7. İstatistiksel Analiz
Gruplar arası ve gruplar içi farklılıkların istatistiksel önemi One Way ANOVA ve Duncan testi ile değerlendirildi. Bunun için SPSS-13 istatistiksel paket programı kullanıldı. Bütün çizelgeler için aynı satırdaki ve sutundaki farklı harfler istatistik olarak farklıdır. Satırlar gruplar arası (a,b,c,d,e…), sutunlar ise grup içi farklılıkları (x,y,z,v…) göztermektedir. p<0.05 için önemlidir.