Gerçek-zamanlı PCR Deneyleri

Belinostat ve Romidepsin’in T98G, U87MG ve U373 hücrelerinde apoptozla ilişkili genlerin ekspresyonuna olan etkisi kantitatif gerçek-zamanlı PCR (qRT-PCR) yöntemi ile analiz edilmiştir. Hem kontrol gruplarından hem de Belinostat ve Romidepsin uygulanmış gruplardan, 24 saat sonunda RNA izolasyonu yapılarak cDNA sentezi gerçekleştirilmiştir. İlgili hücre hatlarında Tablo 3.7’de belirtilmiş olan apoptoz ile ilişkili genlerin mRNA düzeyindeki ekspresyonları araştırılmıştır. GAPDH housekeeping geni sonuçların normalizasyonunda kullanılmıştır.

Belinostat’ın T98G hücre hattında pro-apoptotik genler üzerine etkisi incelendiğinde; Belinostat uygulanmış T98G hücrelerinde Hrk, Noxa, Bak, Bik ve kaspaz-9 genlerinin ekspresyonunun kontrol grubuna göre arttığı görülmüştür. Anti-apoptotik genler açısından bakıldığında; Mcl-1, XIAP, Bcl-W, Birc 5 ve Birc 8 genlerinde doz grubunda kontrol grubuna göre ekspresyonun azaldığı gözlenmiştir (Şekil 4.43 ve 4.44). Bu sonuçlar, T98G hücrelerinde TRAIL-duyarlılığını arttıran Belinostat’ın hem pro-apoptotik hem de anti-apoptotik Bcl-2 ailesi üyeleri üzerine etkisinin olduğunu göstermektedir. Ayrıca, Belinostat’ın intrinsik yolakta görev alan kaspaz-9 ve kaspaz inhibitörü olan cIAP üyesi Birc’lere de etkisinin olduğu görülmektedir. Bu nedenle, Belinostat’ın TRAIL ile kombine uygulamasında apoptozu tetiklemesinde yukarıda belirtilen apoptotik ve anti- apoptotik genler üzerinden işlev gördüğünü söyleyebiliriz.

U87MG hücrelerinde Belinostat, T98G hücreleriyle benzer şekilde HRK, Noxa ve Kaspaz-9 genlerinin ekspresyonunu, aynı zamanda pro-apoptotik Bcl-2 ailesi üyesi Bik,

Bim ve Bcl-2 modifiye edici faktör Bmf’nin ekspresyonunu anlamlı şekilde arttırdığı

belirlenmiştir (Şekil 4.45 ve 4.46). Anti-apoptotik genler açısından bakıldığında; Mcl-1,

XIAP, Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-W, Birc 2 ve Birc 5 genlerinin ekspresyonunu da anlamlı şekilde

azalttığı görülmüştür (Şekil 4.47). Bu sonuç bize, Belinostat’ın U87MG hücrelerinde TRAIL ile apoptozu indüklerken, ekstrinsik yolak üzerinden MOMP’un tetiklenmesine ve kaspazların inhibisyonuna neden olacak genlerin aktivasyonuna neden olabileceğini çağrıştırabilmektedir.

Şekil 4.43 Belinostat’ın T98G hücrelerinde pro-apoptotik genlerin ekspresyonu üzerine

etkisi.

Şekil 4.44 Belinostat’ın T98G hücrelerinde anti-apoptotik genlerin ekspresyonu üzerine

Şekil 4.45 Belinostat’ın U87MG hücrelerinde pro-apoptotik genlerin ekspresyonu

üzerine etkisi.

Şekil 4.46 Belinostat’ın U87MG hücrelerinde anti-apoptotik genlerin ekspresyonu

üzerine etkisi.

TRAIL-dirençli U373 hücre hattında Belinostat’ın pro-apoptotik genlerden Noxa, Bim,

Bmf, kaspaz-9 ve kaspaz-10’un ekspresyonlarını kontrol grubuna göre anlamlı şekilde

arttırmıştır (Şekil 4.48). Anti-apoptotik genlerin ekspresyonuna bakıldığında; Belinostat’ın Mcl-1, XIAP, Bcl-2, BCL2L10, Bcl-W, Birc 2 ve Birc 8 ekspresyonlarını kontrol grubuna göre azaltmıştır (Şekil 4.49). Bu sonuçlarla, Belinostat’ın TRAIL-indüklü apoptozu arttırırken, pro-apoptotik ve anti-apoptotik Bcl-2 ailesi üyeleriyle birlikte kaspaz- 9, -10 ve Birc genleri üzerine etki ettiğini düşünebiliriz.

T98G, U87MG ve U373 hücre hatları için tüm sonuçlar değerlendirildiğinde, Belinostat’ın GBM hücre hatlarını TRAIL’a duyarlı hale getirmede ve TRAIL-aracılı apoptozu arttırmada, pro-apoptotik ve anti-apoptotik Bcl-2 ailesi üyeleri, kaspaz-9, -10 ve cIAP üyeleri üzerinden rol oynadığını söyleyebiliriz. Bu sonuçlar, Belinostat için hipotezimizde belirtilen; HDACi’lerin apoptotik yolaktaki genler üzerine etki edebileceği düşüncesini doğrulamaktadır.

Şekil 4.47 Belinostat’ın U87MG hücrelerinde anti-apoptotik genlerin ekspresyonları

Şekil 4.48 Belinostat’ın U373 hücrelerinde pro-apoptotik genlerin ekspresyonu üzerine

etkisi.

Şekil 4.49 Belinostat’ın U87MG hücrelerinde anti-apoptotik genlerin ekspresyonları

Romidepsin’in T98G hücre hatlarındaki gen ekspresyon değişimlerine bakıldığında, kontrol grubuna göre DR5, HRK, Puma, Noxa ve kaspaz-9’un ekspresyonlarını anlamlı şekilde arttırdığı gözlenmiştir. Bununla birlikte en belirgin artışın kontrole göre, 111 kat ile Bik ve 12 kat ile HRK’da meydana geldiği görülmektedir (Şekil 4.50 ve 4.51). Anti- apoptotik genlere bakıldığında, Mcl-1, XIAP, Bcl-XL, Bcl-W, Birc 2, Birc 5, Birc 6 ve Birc 8’de kontrol grubuna göre ekspresyonun anlamlı şekilde azaldığı bulunmuştur (Şekil 4.52). Sonuçlar birlikte değerlendirildiğinde, Romidepsin’in ölüm reseptör ekspresyonunu arttırarak ve hem ekstrinsik hem de intrinsik yolakta rol oynayan Bcl-2 ailesi üyeleri üzerine etki ederek T98G hücrelerinde TRAIL-aracılı ölüme yardım ettiği sonucu çıkarılabilir.

Şekil 4.50 Romidepsin’in T98G hücrelerinde pro-apoptotik genlerin ekspresyonu üzerine

Şekil 4.51 Romidepsin’in T98G hücrelerinde Bik gen ekspresyonu üzerine olan etkisi.

Şekil 4.52 Romidepsin’in T98G hücrelerinde anti-apoptotik genlerin ekspresyonları

Romidepsin’in U87MG hücrelerinde 24 saatlik uygulaması sonucu, pro-apoptotik genlerden DR5, HRK, Puma, Noxa, Bim, Bik, Bmf ve kaspaz-9’un ekspresyonlarını kontrol grubuna göre anlamlı şekilde arttırmıştır (Şekil 4.53). U87MG hücrelerinde Romidepsin uygulaması sonucu anti-apoptotik genlerin ekspresyon durumuna bakıldığında; XIAP, Bcl-2, Bcl-XL, BCL2L10, Birc 2 ve Birc 5 genlerinin ekspresyonlarının kontrol grubuna göre anlamlı şekilde azaldığı görülmüştür (Şekil 4.54). Bu genlerdeki ekspresyon değişimlerine bakarak, Romidepsin’in U87MG hücrelerinin TRAIL’e duyarlılığını ölüm reseptör DR5 ‘in ekspresyonunu arttırarak, özellikle pro-apoptotik ve anti-apoptotik Bcl-2 ailesi üyeleri üzerinden gerçekleştirdiğini, aynı zamanda MOMP üzerinde de Bcl-2 ve Bcl-XL genlerinin ekspresyonunu azaltarak görev aldığını söyleyebiliriz.

Şekil 4.53 Romidepsin’in U87MG hücrelerinde pro-apoptotik genlerin ekspresyonu

TRAIL-duyarlı U373 hücrelerindeki duruma baktığımızda, Romidepsin’in DR5, HRK,

Puma, Noxa, Bak, Bim, Bik, Bmf ve kaspaz-9 genlerinin ekspresyonlarını kontrol

grubuyla karşılaştırıldığında anlamlı şekilde arttırmıştır (Şekil 4.55). Anti-apoptotik genler açısından incelendiğinde ise, kontrol grubuna göre Mcl-1, XIAP, Bcl-2, BCL2L10, Bcl-W,

Birc 2, Birc 5 ve Birc 6 gen ekspresyonlarının Romidepsin uygulanan grupta anlamlı

şekilde azaldığı görülmüştür (Şekil 4.56). Bu sonuçlar ışığında, Romidepsin’in U373 hücrelerinin TRAIL’e olan direncini kırmada ölüm reseptörü DR5, kaspaz-9 ve pro- apoptotik Bcl-2 ailesi üyelerinin ekspresyonlarını arttırarak, aynı zamanda anti-apoptotik genlerin ekspreyonlarını azaltarak görev aldığı söylenebilir.

Üç GBM hücre hattı için tüm sonuçlar değerlendirildiğinde, Romidepsin’in GBM hücre hatlarını TRAIL’a duyarlı hale getirmede ve TRAIL-aracılı apoptozu arttırmada, pro- apoptotik ve anti-apoptotik Bcl-2 ailesi üyeleri, kaspaz-9 ve cIAP üyeleri üzerinden rol oynadığını söyleyebiliriz. Bu sonuçlar, Romidepsin için; hipotezimizde belirtilen; HDACi’lerin apoptotik yolaktaki genler üzerine etki edebileceği düşüncesini doğrulamaktadır.

Şekil 4.54 Romidepsin’in U87MG hücrelerinde anti-apoptotik genlerin ekspresyonları

Şekil 4.55 Romidepsin’in U373 hücrelerinde pro-apoptotik genlerin ekspresyonu üzerine

etkisi.

Şekil 4.56 Romidepsin’in U373 hücrelerinde anti-apoptotik genlerin ekspresyonları