situações basais e catabólicas
Após a devida validação do sistema de estudo, averiguamos o efeito de moduladores da sinalização mediada pelo AMPc na proteólise muscular esquelética em situações basais e catabólicas, via de sinalização que vem sendo estudada há mais de 10 anos em nosso laboratório. Vários autores demonstraram o papel desse sistema nos processos de degradação protéica e na manutenção do trofismo muscular, abrindo uma nova perspectiva terapêutica para doenças associadas à atrofia muscular (Koopman et al., 2009; revisão). Navegantes et al. (2000) foram pioneiros em demonstrar o envolvimento da cascata de sinalização na regulação da proteólise muscular. Cabe ressaltar que os resultados descritos por seu grupo, assim como por outros autores, foram obtidos utilizando*se apenas músculos de animais impúberes, devido à limitação metodológica que imperava até então.
No presente estudo, a resposta do músculo lumbricalis à ativação da via AC/AMPc foi primeiramente analisada utilizando o agonista não seletivo de adrenoceptores β * isoproterenol. Evidenciamos que esta droga reduziu em 20% a proteólise muscular de animais adultos controles, de forma concentração* dependente (figura 16). Mostramos ainda que o isoproterenol atenua o hipercatabolismo de músculos lumbricales desnervados (figura 17), reforçando dados obtidos em músculos esqueléticos de ratos impúberes (Navegantes et al., 2000).
Por ser um agonista de adrenoceptores β não seletivo, o isoproterenol exerce seu efeito anticatabólico em concentrações que ativam tanto adrenoceptores β1 como β2. Assim, os efeitos cardiovasculares indesejáveis da droga inviabilizam sua utilização terapêutica (Koopman et al., 2009; revisão). Por outro lado, o agonista seletivo β2 formoterol, broncodilatador classicamente utilizado na reversão da crise asmática, reduziu a proteólise muscular de forma concentração*dependente (Figura 18). A droga apresentou alta potência farmacológica (na ordem de nM) em relação ao isoproterenol (na ordem de iM), abrindo a perspectiva de seu uso clínico para a atenuação do catabolismo muscular exacerbado.
Além disso, o formoterol também atenuou o hipercatabolismo do músculo desnervado (Figura 19), comprovando seu potencial terapêutico. Cabe ressaltar que o formoterol é classificado como uma droga de longa duração (Anderson, 1991; revisão), devido as suas propriedades farmacocinéticas, o que traria vantagens na utilização crônica.
Por fim, o envolvimento da via de sinalização do AMPc no controle da proteólise muscular no animal adulto foi confirmado pela redução da liberação de tirosina pela forscolina (figura 21). Como esta droga consegue ativar diretamente a AC, nossos dados demonstram que o aumento da síntese de AMPc, independente do GPCR ou da proteína Gs, é condição suficiente para um efeito anticatabólico. Por outro lado, a diminuição do catabolismo muscular pelo inibidor de fosfodiesterases IBMX indica a existência de uma síntese basal de AMPc responsável pela modulação do metabolismo de proteínas (figura 20).A demonstração que o efeito anticatabólico da via de sinalização do AMPc pode ser alcançada na ausência da ativação do receptor acoplado à proteína Gs estimulatória ou da inibição da fosfodiesterase coloca a adenilil ciclase e fosfodiesterases como alvos farmacológicos para desenvolvimento de medicamento que atenuem o catabolismo muscular.
É interessante notar que todos os moduladores da via de sinalização do AMPc utilizados alcançaram uma inibição máxima da proteólise da ordem de 20%. Dados recentes obtidos em animais impúberes (Navegantes et al., 2009; revisão) mostram que análogos do AMPc, como dibutiril*AMPc, inibem calpaínas intracelulares por um mecanismo dependente da ativação de PKA. Devido ao tempo de incubação dos músculos ser relativamente curto (2h), é possível que os mecanismos anticatabólicos sejam principalmente não*genômicos, via fosforilção de proteínas chave. Possivelmente, os moduladores da via de sinalização do AMPc estejam inibindo a proteólise via ativação de PKA e fosforilação de calpaínas, culminado na redução global da degradação de proteínas (Navegantes et al., 2009; revisão). Esta hipótese pode ainda ser suportada pelo fato de a incubação dos músculos lumbricales com inibidores de calpaínas ter reduzido a proteólise basal também em 20% (figura 13).
De fato, formoterol, IBMX e forscolina promoveram inibição máxima de 20% da proteólise muscular, determinada tanto em músculos de animais adultos como impúberes, sugerindo que uma contribuição semelhante da via de sinalização do
AMPc na regulação do catabolismo de músculos de animais impúberes e adultos. Comparando a proteólise basal de músculos lumbricales de animais impúberes e adultos, observamos que a proteólise muscular do animal impúbere é quase o dobro daquela do animal adulto (figura 22), dado que poderia impedir a extrapolação de resultados obtidos em animais impúberes para adultos.
Por fim, testamos o efeito desses moduladores também em músculos EDL de animais impúberes, e obtivemos resultados similares aos de animais adultos (figura 23), além daqueles obtidos por Navegantes et al. (2000), o que valida o uso do músculo lumbricalis para o estudo da proteólise muscular, e confirma a ação anticatabólica da via de sinalização do AMPc durante as diferentes fases do desenvolvimento animal. Embora nossos dados demonstrem que é possível extrapolar as ações anticatabólicas da via do AMPc observada em músculos de animal impúbere para o adulto, deve*se salientar que resultados de outras vias de sinalização podem não ser igualmente extrapoláveis.
Em resumo, os resultados obtidos nesse trabalho podem abrir um leque de opções para o estabelecimento de terapêutica medicamentosa para minimizar a atrofia muscular inerente a estados catabólicos crônicos, colocando a via de sinalização do AMPc como um alvo farmacológico importante para a atenuação do catabolismo muscular. Além disso, a identificação de substâncias endógenas sistêmicas ou secretadas pelo neurônio motor que modulem a proteólise muscular via proteína Gs/AC/AMPc se faz necessária, o que pode aumentar nossa compreensão atual acerca do controle neural da proteólise muscular, um tema claramente obscuro na literatura atual.
Em conjunto, os resultados apresentados permitiram:
a padronização de um micrométodo para a medida do aminoácido tirosina, diminuindo o consumo de reagentes e aumentando o rendimento de dosagem;
a caracterização do músculo lumbricalis como um novo modelo
de estudo da proteólise muscular esquelética incluindo aquela de animais adultos ou portadores de doenças relacionadas ao envelhecimento, neurodegenerativas ou não;
demonstrar que a proteólise muscular no animal impúbere é significantemente maior que aquela do animal adulto, sugerindo modificações da proteólise durante a maturação do animal relacionadas ao processo de crescimento muscular;
demonstrar que a via de sinalização do AMPc está fortemente associada à regulação da proteólise muscular, o que pode colocar essa via de sinalização como um potencial alvo farmacológico para modulação e a atenuação do catabolismo muscular.
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