A partir dos resultados de heteroplasmia apresentados anteriormente e devido as dificuldades técnicas enfrentadas nas análises por imunofluorescência, decidimos investigar a existência de mecanismos autofágicos através do perfil de expressão gênica das iPSCs. Além de avaliar o efeito da alta heteroplasmia do grupo MELAS, analisamos o efeito do tratamento com promotor (rapamicina) e inibidor (mdivi-1) de autofagia.
Ao analisar a expressão dos transcritos que codificam subunidades do Complexo I (MT-ND2), II (SDHA), III (MT-CYB) e IV (MT-CO1) verificamos que esses encontram-se, no geral, mais expressos em iPSCs MELAS em relação ao Controle (Figuras 18, 19, 20 e 21). Como a transcrição do mtDNA é policistrônica (STEWART; CHINNERY, 2015) era esperado um aumento em conjunto dos mRNAs codificados pelo mtDNA (complexos I, III e IV).
Esses resultados corroboram os dados de cópias de mtDNA, uma vez que as iPSCs MELAS estão sob efeito da mutação, o que resulta num aumento da transcrição e replicação,
condizente com o que é observado em pacientes com doenças mitocondriais (HÄMÄLÄINEN et al., 2013). Esse efeito foi principalmente evidente no caso da SDHA (complexo II) que é codificada pelo núcleo e sua expressão elevada é comumente utilizada para o diagnóstico de doenças mitocondriais (WONG et al., 2010). Normalmente, em paciente com doenças mitocondriais, observa-se um aumento da proteína SDHA e uma diminuição da MT-CO1. A diminuição da MT-CO1 é explicada pelo defeito que MELAS causa sobre a síntese proteica mitocondrial por afetar o tRNA-leu. Como aqui analisamos a quantidade de transcritos e não de proteínas, não observados tal efeito sobre a MT-CO1.
Com relação ao efeito dos tratamentos com rapamicina e mdivi-1, não verificamos uma resposta clara destes sobre a expressão de genes envolvidos na cadeia transportadora de elétrons. Nossa intenção com esses tratamentos era estimular/desestimular a autofagia. No entanto, uma vez que a quantidade de mutação nas iPSCs MELAS é muito elevada, o estimulo autofágico em nada deve ter contribuído para minimizar a disfunção mitocondrial, o que explica porque os tratamento não revelaram um padrão de expressão para estes genes.
Figura 18: Expressão relativa de MT-ND2 em iPSCs Controle e MELAS. As barras indicam a
média e o erro padrão da média de cada tratamento. Foi observado efeito de grupo (P < 0,0001), sendo a expressão de MT-ND2 maior no grupo MELAS e efeito de tratamento (P = 0,0092), sendo a expressão de MT-ND2 maior no tratamento com mdivi-1, do que no grupo DMSO que por sua vez foi maior que no grupo Rapamicina.
Figura 19: Expressão relativa de SDHA em iPSCs Controle e MELAS. As barras indicam a média e
o erro padrão da média de cada tratamento. Foi observado efeito de interação Grupo X tratamento (P = 0,0169).
Figura 20: Expressão relativa de MT-CYB em iPSCs Controle e MELAS. As barras indicam a
média e o erro padrão da média de cada tratamento. Foi observado efeito de interação Grupo X tratamento (P = 0,0273).
Figura 21: Expressão relativa de MTCO1 em iPSCs Controle e MELAS. As barras indicam a média
e o erro padrão da média de cada tratamento. Foi observado efeito de Grupo (P = 0,0005) sendo a expressão de MTCO1 maior no grupo MELAS.
Ao avaliar a expressão dos transcritos que codificam PINK1 e PARKIN (Figuras 22 e 23) verificamos que PINK está menos expressa em iPSCs do grupo MELAS em relação ao Controle. As proteínas PINK e PARKIN são essenciais para o processo de mitofagia (GILKERSON et al., 2012; LAZAROU et al., 2015). Em condições de estresse, como por exemplo, despolarização mitocondrial, PINK1 acumula na superfície da mitocôndria e faz com que haja a importação da proteína PARKIN do citosol (QUIRÓS; LANGER; LÓPEZ- OTÍN, 2015). Isso leva a poli-ubiquitinação de várias outras proteínas da membrana mitocondrial (e.g., MFN1, TOMM20), o que faz com haja reconhecimento da maquinaria autofágica, provocando a degradação específica da mitocôndria (QUIRÓS; LANGER; LÓPEZ-OTÍN, 2015). Apesar de curioso num primeiro momento, o resultado encontrado pode demonstrar um baixo estímulo para produção de transcritos de PINK1 nas iPSCs de MELAS, possivelmente causado pelo acúmulo da proteína PINK1 na mitocôndria. Essa suposição é sustentada ao verificar que PARKIN encontra-se quase três vezes mais expressa em MELAS em relação ao Controle (P < 0,0001). Além disso, uma vez que PARKIN está a posteriori em relação a PINK na cadeia de regulação da mitofagia (GILKERSON et al., 2012), a superexpressão de PARKIN por si só já indica um estímulo autofágico dirigido à mitocôndria. Como relatado por Gilkerson et al. (2012) a superexpressão de PARKIN em
células Rho 0 (sem mtDNA) foi suficiente para induzir a destruição autofágica das mitocondriais disfuncionais. Outro trabalho realizado por Suen et al. (2010) revelaram que a super expressão induzida de PARKIN em cíbridos (citoplasma híbrido) reduz o nível da mutação patogênica em aproximadamente 20% para uma mutação no gene mitocondrial
MT-CO1(SUEN et al., 2010).
Figura 22: Expressão relativa de PINK1 em iPSCs Controle e MELAS. As barras indicam a média e
o erro padrão da média de cada tratamento. Foi observado efeito de grupo (P < 0,0001) sendo a expressão de PINK1 maior no grupo MELAS.
Figura 23: Expressão relativa de PARKIN em iPSCs Controle e MELAS. As barras indicam a
média e o erro padrão da média de cada tratamento. Foi observado efeito de grupo (P < 0,0001) sendo a expressão de PARKIN maior no grupo MELAS.
Portanto, esses resultados indicam um estímulo autofágico nas iPSCs do grupo MELAS. Para confirmar esse efeito, avaliamos a expressão de DNM1L e OPA1, os quais desempenham papel central na dinâmica mitocondrial (Figura 24 e 25). A superexpressão da DNM1L encontrada nas iPSCs de MELAS indica uma possível condição de fragmentação mitocondrial, o que é condizente com uma maior ocorrência de mitofagia nesse grupo. Como revelado por Twig et al. (2008), a fragmentação mitocondrial é essencial para que os autofagossomos possam engolfar mitocôndrias fadadas à destruição nos lisossomos. Além disso, verificamos que o tratamento com Rapamicina fez com que as células tanto do grupo Controle quanto do grupo MELAS tivessem menor quantidade de transcritos para DNM1L. (Figura 24).
Figura 24: Expressão relativa de DNM1L em iPSCs Controle e MELAS. As barras indicam a média
e o erro padrão da média de cada tratamento. Foi observado efeito de grupo (P < 0,0001) sendo a expressão de PARKIN maior no grupo MELAS. Foi observado efeito de tratamento (P = 0,0314) sendo mdivi-1 e DMSO maior que Rapamicina.
Com relação a análise da OPA1, responsável por mediar a fusão das membranas interna da mitocôndria, essa também se mostrou aumentada no grupo MELAS (Figura 25). Esse resultado é paradoxal uma vez que esperamos encontrar uma baixa expressão de OPA1 indicando um possível deslocamento da razão fusão/fissão no sentido da fissão mitocondrial. Mas como demonstrado por Chen et al. (2005) entre outros (CIPOLAT et al., 2004; OLICHON, 2003), a superexpressão de OPA1 também resulta em fragmentação mitocondrial, e portanto suportam a suposição de que há maior ocorrência de mitofagia no grupo iPSCs MELAS. Além disso, trabalhos recentes demonstraram que a OPA1 está também envolvida no processo autofágico (QUIRÓS; LANGER; LÓPEZ-OTÍN, 2015). A OPA1 tem 8 isoformas diferentes, e sua forma completa é conhecida como L-OPA1, porém em condições de estresse a L-OPA1 pode ser clivada por uma mitoprotease chamada OMA1. A completa clivagem de L-OPA1 realizada pela OMA1 inibe a fusão e está associada com fragmentação mitocondrial (QUIRÓS; LANGER; LÓPEZ-OTÍN, 2015). Várias condições de estresse ativam a OMA1, como por exemplo estresse oxidativo, estresse térmico e despolarização da mitocôndria. Ao avaliarmos a expressão dos transcritos de OMA1 (Figura 26), verificamos que há maior expressão deste em iPSCs MELAS em relação ao Controle, confirmando a hipótese anterior de que há maior ocorrência de
mitofagia nas iPSCs do grupo MELAS. No entanto, a análise da quantidade de proteína L- OPA1 e S-OPA1, bem como de OMA1 por experimentos de Western Blot são importantes para confirmar esses resultados.
Figura 25: Expressão relativa de OPA1 em iPSCs Controle e MELAS. As barras indicam a média e
o erro padrão da média de cada tratamento. Foi observado efeito de grupo (P < 0,0001) sendo a expressão de OPA1 maior no grupo MELAS. Foi observado efeito de tratamento (P = 0,0493), sendo mdivi-1 maior que Rapamicina.
Figura 26: Expressão relativa de OMA1 em iPSCs Controle e MELAS. As barras indicam a média e
o erro padrão da média de cada tratamento. Foi observado efeito de grupo (P < 0,0001) sendo a expressão de OMA1 maior no grupo MELAS.
Com o intuito de confirmar os resultados encontrados acima, analisamos a expressão de transcritos de FBXO7 (Figura 27), outro componente da via da mitofagia (NELSON; RANDLE; LAMAN, 2013). A FBXO7 interage diretamente com PARKIN, através do seu domínio Ubl, ajudando a recrutá-lo para a mitocôndria para iniciar o processo de mitofagia (NELSON; RANDLE; LAMAN, 2013). Verificamos que há maior expressão de FBXO7 em iPSCs MELAS (Figura 27), evidenciando o estresse causado pela elevada quantidade de mutações no mtDNA. Em concordância com esse resultado, um trabalho recente de Zhou Z. et al. (2015) mostrou que a FBXO7 além de ser vital para a mitofagia, tem sua expressão aumentada em condições de estresse (ZHOU et al., 2015).
Figura 27: Expressão relativa de FBXO7 em iPSCs Controle e MELAS. As barras indicam a média
e o erro padrão da média de cada tratamento. Foi observado efeito de grupo (P < 0,0012) sendo a expressão de FBXO7 maior no grupo MELAS.
7 CONCLUSÕES
Neste estudo, propomos a utilização de iPSCs derivadas de pacientes com doenças mitocondriais como modelo de estudo para investigar a eliminação de moléculas de mtDNA com mutações patogênicas.
Verificamos que a derivação das linhagens de fibroblastos portadoras de KSS resultou em iPSCs com níveis quase indetectáveis de mtDNA mutante (< 0,1%) o que
impossibilitou testar a hipótese principal deste trabalho. Já a derivação de iPSCs a partir de fibroblastos portadores de MELAS gerou iPSCs com alta taxa da mutação (> 98%) e essas apresentaram diminuição da heteroplasmia ao longo do cultivo. Apesar do tratamento com Rapamicina não resultar em diminuição da heteroplasmia durante a reprogramação, verificamos que há fortes indícios da existência de mecanismos autofágicos direcionados a mitocôndria em iPSCs MELAS.
Portanto de acordo com a hipótese inicial, a reprogramação celular nas iPSCs MELAS resultou em alterações mitocondriais que levaram a seleção negativa de moléculas de mtDNA com mutações patogênicas, com fortes evidências da existência de mecanismos autofágicos.
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