GC-MS yöntemi ile toplam uçucu aroma maddeleri analizi

3. GEREÇ ve YÖNTEM

3.2. Yöntem

3.2.1. Piyasadan Toplanan ve Kontrollü Şartlar Altında Fermente Edilen Gilaburu Suyu

3.2.1.6. GC-MS yöntemi ile toplam uçucu aroma maddeleri analizi

Gilaburu suyu örneklerin toplam uçucu aroma maddeleri head space GC-MS yöntemi kullanılarak belirlenmiştir. Çalışmada DBWAX kolon kullanılarak taze ve fermente gilaburu sularında oluşan farklı uçucu aroma maddeleri saptanmıştır. Aroma madde tayini

MACHIELS ve ISTASSE (2003)’ye göre yapılmıştır. 5 mL gilaburu suyu örneği viallere doldurulmuştur. Vialler öncelikle 50°C’de 20 dakika süreyle bekletilmiştir. Sonrasında viale fiber daldırılarak 20 dakika daha 50°C’de bekletilmiştir. Fiber cihaza enjekte edilmiştir.

Desorpsiyon sırasında fırın sıcaklığı 35°C olup, bu sıcaklıkta 3 dakika tutulmuştur. Metotta belirtildiği şekilde 10°C/dk oranında bir artış ile sıcaklık 50°C’ ye yükseltilmiş, sonrasında 4°C/dk’ lık bir artışla 200°C’ ye ayarlanmıştır. Son olarak da 50°C/dk’ lık bir artışla sıcaklık 250°C’ ye yükseltilerek, bu sıcaklıkta 10 dk süreyle tutulmuştur. Taşıyıcı gaz olarak helyum kullanılmış ve helyum akış hızı 1.5 mL/dk olarak ayarlanmıştır. Daha sonra kromatogramda görülen pikler Flavor 2, HPCH 1607 ve Wiley7nNIST isimli kütüphaneler taranarak % olarak tanımlanmıştır.

3.2.2. Gilaburu sularından LAB izolasyonu ve tanımlanması

3.2.2.1. Laktik Asit Bakterileri (LAB)'nin izolasyonu ve saflaştırılması

LAB izolasyonu için ise, MRS besiyerlerinde yayma ekim yöntemi kullanılacak ve ekim yapılan petriler 30±0.1ºC ’de 72 saat anaerobik olarak inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonunda petrilerden birbirinden farklı görünümdeki koloniler seçilmiş ve birkaç kez saflaştırılmıştır.

Bakteri izolatları DNA’nın ekstraksiyonu, amplifikasyonu, jelde yürütülmesi, saflaştırılması ve dizi analizi olmak üzere 5 aşamadan geçerek genotipik olarak tanımlanmıştır.

3.2.2.2. LAB ’nden DNA izolasyonu

LAB ’nden DNA izolasyonu için ticari DNA izolasyon kiti (İnvitrogen) kullanılmıştır.

Öncelikle eppendorf tüplerine (2ml’lik) 180 µl lizozimli izolasyon solüsyonu (20 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA pH 8, 0.3 mM lizozim) ilave edilmiştir. Saf kolonilerden öze ile 2-3 loop alınarak tüplerde bulunan lizozim solüsyonu ile süspanse edilmiştir. Elde edilen süspansiyon 37°C 'de 45 dk inkübe edilmiş ve 20 µl Proteinaz K eklenmiş ve 56°C 'de 2 saat inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonunda 200 µl Genomic Lysis/Binding Buffer (İnvitrogen) eklenmiş ve 70°C de 15 dk inkübe edilmiştir. Daha sonra oda sıcaklığına soğutulmuş ve spin kolonlara alınmıştır. Spin kolon 200 µl etanol eklenip kısa bir karıştırıldıktan sonra spin klonlar 6000 x g 'de 1 dk santrifüj edilerek DNA ’nın silika membranda tutulması sağlanmıştır. Daha sonra spin kolonlar önce 500 µl Genomic Wash Buffer 1 (İnvitrogen) daha sonra ise yine 500 µl Genomic Wash Buffer 2 ile yıkanmıştır. 20000 x g 'de 3 dk santrifüj edilen tüpler oda sıcaklığında yaklaşık 30 dk kurumaya bırakılmıştır. Kurutma işleminin sonunda spin

kolonlara 50 µl Genomic elution buffer (Invitrogen) eklenip 10000 x g 'de 1 dk santrifüj işlemi uygulanmıştır. Elüe edilen DNA’ların konsantrasyonları nanodrop (nanospektrofotometre) (ACTGene) ile ölçülerek belirlenmiştir (KESMEN ve ark., 2012).

3.2.2.3. LAB ’nin rep PCR (GTG5) analizi

Proje kapsamında tüm örneklerden toplam 332 farklı izolat elde edilmiştir. Daha önce elde edildiği belirtilen 400 civarı izolatın aynı örnekten alınan bazılarının, mikroskobik görüntüleri ve benzer özellikleri dolayısıyla, aynı örnekteki-aynı bakteri olduğu için, iş yükünü azaltmak için aynı izolatlar çalışma kapsamından çıkarılmıştır. Tüm izolatların tanımlanmasında 16 S rRNA geninin tüm baz dizisinin dizi analizi ile ortaya çıkarılmasına ilave olarak dizi analizi maliyetini düşürmek için aynı türe ait izolatların rep PCR (GTG5) yöntemi ile fingerprint analizi gerçekleştirilmiştir. Ayrıca doğrulama yapmak için ikinci bir PCR yöntemi olarak ta BOX PCR yöntemi uygulanmıştır (KESMEN ve ark., 2012).

DNA amplifikasyonu

Bu amaç için 15 µl Taq PCR mix (Fermentas),12. 5 µl PCR grade su 100 ng her bir saf kültürden izole edilen template DNA ve 0.5 µM GTG5 (5'-GTG GTG GTG GTG GTG-3') primerden oluşan reaksiyon karışımı hazırlanmıştır. Hazırlanan karışımı Termal Cycler’da 95°C ’de 10 dk ilk denatürasyon ve 94°C ’de 1 dk denaturasyondan sonra 40°C ’de 1 dk annealing ve her döngüde 65°C ’de 8 dk ekstensiyon uygulanmıştır. Toplam 35 döngü uygulanmış olup en son ekstensiyon aşaması 65°C ’de 16 dk olarak gerçekleştirilmiştir. PCR ürünleri daha sonra %1.5 ’lik agaroz jelde 20 X 25 cm’lik bir yatay elektroforez tankında 50 V ’luk sabit voltajda 4°C’de 20 saat yürütüldükten sonra görüntülenmiştir (KESMEN ve ark., 2012).

3.2.2.4. DNA saflaştırılması, 16 S rRNA geninin baz dizisinin eldesi ve gen bankasındaki dizilerle karşılaştırılması

Rep PCR ve BOX PCR analizi ile izolatların akrabalık ilişkileri ortaya çıkarılmış ve farklı türden oldukları belirlenen izolatların her birinden en az iki adet seçilmiş ve yaklaşık 1500 bazlık 16 S rRNA geninin tüm dizisi ortaya çıkarılarak tanımlanmıştır. Bu amaçla 15 µl Taq PCR mix (Fermentas), 12. 5 µl PCR grade 100 ng her bir saf kültürden izole edilen template DNA ve 0.5 µM ileri primer LPW57 (5’-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) ve 0.5 µM geri

primerden LPW205 (5’-CTTGTTACGACTT CACCC-3’) oluşan reaksiyon karışımı hazırlanmıştır. Termal döngü şartları; 95°C ’de 10 dk ilk denatürasyon ve 94°C ’de 1 dk denaturasyondan sonra 58°C ’de 1 dk annealing ve her döngüde 72°C ’de 2 dk ekstensiyon uygulanmıştır. PCR ürünlerinin oluşup oluşmadığı 1’lik %(w/v) jelde ve 1 ×TBE buffer içerisinde agaroz elektroforezinde yürütülerek kontrol edilmiştir. Oluşan PCR ürünleri ticari purifikasyon kiti (Invitrogen) ile saflaştırılarak dizi analizi için İontek (İstanbul)’e gönderilmiştir. İontek’ten gelen dizi analiz sonuçları Gen Bankası’nın verileri ile karşılaştırılarak her bir izolat tanımlanmıştır. Bununla birlikte daha önce sucuktan izole edilerek tanımlanmış olan Lb. plantarum, Lb. casei ve Lb. brevis türleri de, tanımlamayı doğrulamak için kontrol olarak kullanılmıştır (KESMEN ve ark., 2012).

3.2.3. Gilaburu suyundan izole edilen ve tanımlanan LAB ’ne uygulanan testler 3.2.3.1. Gram boyama

MRS agar üzerindeki 24 saatlik kolonilere gram boyama yapılarak ve ışık mikroskobunda incelenmiştir (SAGDIC ve ark., 2002).

3.2.3.2. Katalaz testi

Katalaz testi için; mikroorganizma örnekleri MRS broth’da 30ºC±0.1 ’de 24 saat süreyle geliştirilmiş ve kültür üzerine %3’lük Hidrojen peroksit çözeltisinden 2-3 damla ilave edilerek gaz oluşup oluşmamasına bakılarak katalaz özelliği tespit edilmiştir (SAGDIC ve ark., 2002).

3.2.3.3. Glukozdan gaz oluşturma

İzolatlar durham tüpü bulunan MRS sıvı besiyerinde 30ºC‘de 48 saat geliştirilmiş ve bakterilerin gaz oluşturma durumlarına göre ayrımları yapılmıştır (SAGDIC ve ark., 2002).

3.2.3.4. 15ºC ve 45ºC 'de gelişme

İçerisinde 5 ml’lik MRS besiyeri içeren tüplere taze kültürden öze ile aşılama yapılmış, 15ºC ve 45ºC ’de, 48 saatlik inkübasyon sonunda bulanıklık oluşup oluşmamasına göre değerlendirme yapılmıştır (SAGDIC ve ark., 2002).

33 3.2.3.5. Farklı tuz konsantrasyonlarında gelişme

İçerisinde %2 ve %4 sodyum klorür içeren MRS broth besiyerine izolatlar inoküle edilmiş 30±0.1°C’de 24 saat inkübasyona bırakılmış ve inkübasyon sonunda besiyerinde bulanıklık olup olmaması gözlenerek değerlendirilmiştir (SAGDIC ve ark., 2002).

3.2.3.6. İzolatların asit üretme yeteneklerinin belirlenmesi

İzolatların asit üretme yeteneklerini test etmek için MRS sıvı besiyeri bulunan tüplere izolatlardan ayrı ayrı inoküle edilerek ve 30±1°C’de inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyonun 0., 6., 12. ve 24. saatler sonunda kültürlerde pH ölçümleri yapılarak asit üretme özellikleri belirlenmiştir (ARICI ve ark., 2004).

3.2.3.7. İzolatların hidrojen sülfür üretme yeteneklerinin belirlenmesi

İzolatların hidrojen sülfür üretme yeteneklerini belirlemek için, Triple Sugar Iron Agar yatık besiyerine öze ile aktif kültürden ekim yapıldıktan sonra 30±0.1°C’de 2 hafta inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonunda besiyerinin renginde siyahlaşma olup olmadığı gözlenerek hidrojen sülfür üretme özelliği belirlenmiştir (ARICI ve ark., 2004).

3.2.3.8. İzolatların farklı pH 'larda gelişiminin belirlenmesi

MRS sıvı besiyerinin pH’sı 1 N HCl ile 2.5 ve 3.5’e ayarlandıktan sonra steril edilmiştir.

Daha sonra 18 saat geliştirilen taze saf kültürlerden MRS sıvı besiyerine aşılanmış ve 30°C

’de inkübasyona bırakılmış ve inkübasyon sonunda besiyerlerinde bulanıklık olup olmamasına bakılarak bakterilerin farklı asitlerde gelişmesi tespit edilmiştir (ARICI ve ark., 2004).

3.2.3.9. İzolatların safra tuzu toleranslarının belirlenmesi

İzolatların safra tuzu toleranslarını test etmek için, MRS broth besiyerine farklı konsantrasyonlarda (0.0, 0.15, 0.3, 0.6 veya 1.0 g/100 mL) safra tuzu ilave edilerek steril edilmiş. Steril besiyerlerine izolatlardan aşılama yapılarak 30°C ’de inkübe edilmiştir.

İnkübasyon sonunda bulanıklık olup olmamasına bakılarak safra tuzu toleransı belirlenmiştir (ARICI ve ark., 2004).

3.2.3.10. İzolatların antibiyotik duyarlılıklarının belirlenmesi

İzolatların antibiyotik duyarlılıklarını test etmek için 8 adet antibiyotik (Amp-10; ampicillin, C-30; chloramphenicol, VA-30; vancomycin, K-30; kanamycin, P-10; penicillin, S-10;

streptomycin, E-15; erythromycin, TE-30; tetracycline hydrochloride) diski kullanılmıştır.

İzolatların MRS sıvı besiyerindeki 18 saatlik aktif kültürleri 45-50°C ’ye soğutulan steril MRS agar besiyerine %1 oranında ilave edildikten sonra steril petrilere dökülmüştür. Bu şekilde hazırlanan petrilere, petri kabının kenarından 10 mm, birbirlerinden 15 mm uzaklıkta olacak şekilde antibiyotik diskler yerleştirilmiştir. Daha sonra petriler, 30°C ’de 24 saat inkübasyona bırakılmış ve inkübasyon sonunda disklerin etrafında oluşan inhibisyon zonu çapları ölçülmüştür (ARICI ve ark., 2004).

3.2.3.11. Arjininden amonyak (NH3) oluşturma

Arjininden amonyak oluşturma yeteneğinin saptanmasında Arjinin MRS Broth besiyeri kullanılmıştır. 5’er ml’lik besiyerine aktif kültürlerden birer öze aşılanarak 30ºC’de 24 saat inkübasyona bırakılmış ve bu sürenin sonunda Nessler reaktifi katılarak renk değişimi incelenmiştir. Turuncu renk, arjininden amonyak oluşumunun göstergesi olarak kabul edilmiştir (SAGDIC ve ark., 2002).

3.2.3.12. İzolatların Tannaz Aktivitelerinin Test Edilmesi

Gilaburu suyu gibi acı-buruk tadlı meyve sularında acılığın girebilmesi önemli aşamalardan biridir. Bu amaçla elde edilen izolatların acılığı oluşturan tanenleri azaltmada tannaz aktivitesi, KWON ve ark. (2008) belirtiği metotla MRS besiyerine %1 tannik asit eklenerek gerçekleştirilmiştir. İzolatların besiyeri üzerinde geliştikten sonra zon oluşturup oluşturmadığına bakılarak tannaz aktivitesinin olup olmadığına karar verilmiştir.

3.2.3.13. İzolatların Hidrojen Peroksit (H₂O₂) Üretme Yeteneklerinin Test Edilmesi 24 saatlik aktif LAB kültürlerinden %2 oranında yağsız süt besiyerine inoküle edilerek 30±1ºC’de 48 saat inkübasyona bırakılmış ve inkübasyon sonunda 30 ml’ye damıtık su ile tamamlanarak ve 7000 dev/dak hızla 5 dakika santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonrası, üstte kalan kısım alınarak Whatman 42 filtre kağıdından karanlık ortamda süzülmüştür. Süzülen

kısımdan 4’er ml alınarak üzerlerine sırasıyla 0.5 ml sülfürik asit, 0.5 ml amonyum molibden ve 0.5 ml potasyum iyodür çözeltileri ilave edilerek karıştırılmış ve 350 nn dalga boyunda spektrofotometrede ölçümleri yapılmıştır. Sonuçlar, hidrojen peroksit standart eğrisi ile karşılaştırılarak, izolatların hidrojen peroksit üretimleri µg/ml olarak saptanmıştır (TOKSOY, 1996).

3.2.3.14. İzolatların Bakteriyosin Üretme Yeteneklerinin Test Edilmesi

MRS sıvı besiyerindeki bir gecelik aktif kültürlerin 0.2 M sodyum fosfat tamponu ile pH’sı 7.2’ye ayarlanmış, katalaz ilavesi ile H2O2 nötürlenmiş ve böylece MRS agar petrilerine 5 µl damlatıldıktan sonra, 37ºC’de 12 saat inkübe edilerek ve tamponlu yumuşak agar ile yüzey kaplanmıştır. 12 saatlik ek inkübasyondan sonra, petriler, damlanın etrafında gelişmeyi inhibe eden zonlar açısından test edilmiştir (Kontrol grubu indikatör suş olarak nisin üretme yeteneği olan Lactococcus lactis ilave edilerek bakteriyosin üretimi doğrulanmıştır). İnhibitör maddenin protein yapısını test etmek için her bir bakteriyal gelişme noktasının etrafına 10 µl trypsin çözeltisi (10 mg/ml) eklenmiş ve petriler, 37ºC’de 3 saat inkübe edilmiştir. Tripsin damlatılmış zonda gelişmeyi inhibe eden zonun olmayışı, inhibitörlerin proteaz duyarlılığını göstermektedir. Bakteriyosin taraması için, potansiyel patojen ve bozucu bakteriler (Bacillus cereus ATCC 33019, Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia coli O157:H7 ATCC 33150, Listeria monocytogenes ATCC 7644, Salmonella Typhimurium ATCC 14028, Staphylococcus aureus ATCC 25923 ve Yersinia enterocolitica ATCC 27729) kullanılmıştır (TOKSOY, 1996).

3.2.3.15. İzolatların D (-), L (+) ve DL Laktat Üretme Yeteneklerinin Test Edilmesi İzolatların D (-), L (+) ve DL laktat üretme yetenekleri, enzimatik olarak D-laktat and L-laktat dehidrogenaz kitleri (Roche Diagnostic, Germany) kullanılarak saptanmıştır (BOEHRINGER-MANNHEIM, 1989).

3.2.3.16. İzolatların Tutunma Özelliklerinin Test Edilmesi

Probiyotiklerin bağırsak yüzeylerine tutunma kabiliyetlerinin ölçüsü olan hidrofobisite testi VINDEROLA ve REINHEIMER (2003)’e göre tespit edilmiştir. Taze kültürler 12000 dev/dk da 5ºC‘de 5 dk santrifüj edildikten sonra iki kez 50 mM K2HPO4 (pH 6,5) buffer tamponu ile

yıkanmıştır. Daha sonra 3 ml bakteri solüsyonu ve 0,6 ml n-hekzadekan ile vortex’te 120 sn süre ile karıştırılmış ve iki fazın ayrılması için 37ºC‘de bekletilmiştir. Sulu faz dikkatlice alınarak 560 nm’de absorbans ölçülmüştür. İzolatların hücre yüzeyi hidrofobisitesi aşağıdaki formül yardımıyla hesaplanmıştır.

% Hidrofobisite =(A0-A/A0)x100

A0: n-hekzadekan ile ekstraksiyondan önceki absorbans A: n-hekzadekan ile ekstraksiyondan sonraki absorbans

3.2.3.17. İzolatların Antibakteriyel Aktivitelerinin Test Edilmesi

İzolatların MRS sıvı besiyerleri içindeki 24 saatlik taze kültürleri hazırlanmıştır. Daha sonra kültür santrifüjlenerek hücresiz solüsyon elde edilerek ve bu süpernatant petrilere ilave edilmiştir. Antibakteriyel aktivite için seçilen B. cereus ATCC 33019, E. coli ATCC 25922, E. coli O157:H7 ATCC 33150, L. monocytogenes ATCC 7644, S. typhimurium ATCC 14028, S. aureus ATCC 25923 ve Y. enterocolitica ATCC 27729 test bakterilerinin 18 saatlik kültürlerini %1 oranında içeren Nutrient Agar besiyerleri petrilere dökülmüş katılaştıktan sonra 6 mm çapında kuyucuklar açılmıştır. Her bir kuyucuğa antibakteriyel aktivitesi test edilecek izolatın süpernatantı konulmuştur. 24 saat inkübasyon sonunda, kuyucuklar etrafında oluşan inhibisyon zonlarının çapları ölçülmüştür (TOKSOY, 1996; ARICI ve ark., 2004).

3.2.3.18. İzolatların Dondurmaya ve Liyofilizasyona Dayanıklılıklarının Test Edilmesi İzolatlar, MRS broth içinde 30°C’de 24 saat geliştirilmiştir. İzolatlar, 20 dak. süreyle 10.000 devirde santrifüjlenmiştir. Daha sonra hücre peletleri, %50 gliserol içeren fosfat tampon tuzu ile yıkadıktan sonra %10 (w/v) yağsız süt solüsyonu içinde süspanse edilmiştir. Daha sonra hücre süspansiyonları, -80°C dondurulmuş ve liyofilizatörde liyofilize edilmiştir.

Liyofilizasyondan önce ve sonra canlı hücre sayısı; seri dilisyonlar hazırlanarak sayılmış ve sonuçlar koloni oluşturan birim (kob/mL) olarak ifade edilmiştir. Dondurma işleminden önce, yağsız süt solüsyonundan seri dilüsyonlar hazırlanıp MRS agar petrilerine ekim yapılmıştır.

Dondurularak kurutulan örnekler -20, +4 ve +25°C’lerde 75 gün depolanmış ve bu süre sonunda farklı depolama sıcaklıklarındaki her bir örnek dilisyon çözeltisi ile yeniden süspanse

edilerek, seyreltilmiş ve ardından ekim yapılmıştır. Petriler, 30°C’de 48 saat inkübe edilmiş, sayımları yapılmıştır (KOS ve ark., 2008).

3.2.4. Probiyotik Gilaburu Suyu Üretimi ve Yapılan Analizler 3.2.4.1. Probiyotik gilaburu suyu üretimi

Probiyotik gilaburu suyu üretmek için seçilen 3 farklı LAB kültürü (Lb. plantarum 19e, Lb.

brevis 15a ve Lb. casei 20a) ile proje kapsamında olmadığı halde probiyotik özelliği olan 2 farklı referans probiyotik kültür (Lb. rhamnosus ve Lb. casei) kullanılmıştır (Tablo 3.3).

Ancak referans probiyotik kültürlerin gilaburuda gelişememesi neticesinde, bu örnekler denemelerden çıkarılarak izolatlarla denemeler gerçekleştirilmiştir. Bu araştırmada kullanılacak gilaburu suyu pastörize edilmiş bir şekilde Kayseri’ de faliyet gösteren bir meyve suyu fabrikasından (Kayseri Pazarı, Kayseri) temin edilmiştir. LAB gilaburu suyuna katmak için öncelikle aktive edilmiştir. Bu amaç için LAB kültürleri MRS broth’a aşılanmış ve 30°C’de 24 saat inkübe edilmiştir. Daha sonra bu kültüerler tekrar MRS broth’ aşılanarak 30°C’de 24 saat inkübe edilmiştir. LAB kültürleri santrfüj edilmiş 12000 dev/dk da 5ºC‘de 5 dk santrifüj edildikten sonra iki kez 50 mM K₂HPO₄ (pH 6,5) buffer tamponu ile yıkanmıştır.

Daha sonra kültürler steril %0.85’lik tuzlu su ile homojenize edilerek pastörize gilaburu suyuna ilave edilmiştir. Bu arada gilaburu sularına steril %2 glukoz ilave edilmiştir.

hazırlanan gilaburu suları +4°C’de 60 gün depolanmış ve depolamanın 0., 15., 30. ve 60.

günlerinde fizikokimyasal, mikrobiyoloijk, duyusal ve biyoaktif özellikleri incelenmiştir.

Tablo 3. 3. Probiyotik gilaburu üretiminde kullanılan LAB kombinasyonları Örnek No LAB kombinasyonu

1:dışarıdan LAB ilave edilmemiş gilaburu suyu

38 3.2.4.2. Fizikokimyasal analizler

3.2.4.2.1. Suda çözünür katı madde (Briks) 3.2.1.1.1’ de belirtildiği gibi yapılmıştır.

3.2.4.2.2. pH

3.2.1.1.2’ de belirtildiği gibi yapılmıştır.

3.2.4.2.3. Asitlik (%)

3.2.1.1.3’ de belirtildiği gibi yapılmıştır.

3.2.4.2.4. İndirgen şeker

3.2.1.1.4’ de belirtildiği gibi yapılmıştır.

3.2.4.2.5. Protein

3.2.1.1.5’ de belirtildiği gibi yapılmıştır.

3.2.4.2.6. Kül

3.2.1.1.6’ de belirtildiği gibi yapılmıştır.

3.2.4.2.7. Ham selüloz

3.2.1.1.7’ de belirtildiği gibi yapılmıştır.

3.2.4.2.8. Yağ

3.2.1.1.8’ de belirtildiği gibi yapılmıştır.

3.2.4.2.9. Etil alkol

3.2.1.1.9’ de belirtildiği gibi yapılmıştır.

39 3.2.4.3. Biyoaktif Özellik Analizleri

3.2.4.3.1. Askorbik asit

3.2.1.2.1’ de belirtildiği gibi yapılmıştır.

3.2.4.3.2. Toplam fenolik madde 3.2.1.2.2’ de belirtildiği gibi yapılmıştır.

3.2.4.3.3. Antioksidan aktivite

3.2.1.2.3’ de belirtildiği gibi yapılmıştır.

3.2.3.3.4. Serbest radikal temizleme aktivitesi (Antiradikal aktivite) 3.2.1.2.4’ de belirtildiği gibi yapılmıştır.

3.2.4.4. Duyusal analizler

3.2.1.3’ de belirtildiği gibi yapılmıştır.

3.2.4.5. Mikrobiyolojik analizler ve laktik asit bakterilerinin izolasyonu 3.2.4.5.1. Toplam mezofilik aerobik bakteri sayımı (TMAB)

3.2.1.4.1’ de belirtildiği gibi yapılmıştır.

3.2.4.5.2. Asidofilik sporlu bakteri (Alicyclobacillus spp.) sayımı 3.2.1.4.2’ de belirtildiği gibi yapılmıştır.

3.2.4.5.3. Laktik asit bakteri (LAB) sayımı 3.2.1.4.7’ de belirtildiği gibi yapılmıştır.

40 3.2.4.6. Uçucu aroma analizi

3.2.1.6’ de belirtildiği gibi yapılmıştır.

3.2.4.7. Fenolik asit ve flavonoidlerin analizi 3.2.1.5.1’ de belirtildiği gibi yapılmıştır.

3.2.4.8. Antosiyanin analizi

3.2.1.5.6’ de belirtildiği gibi yapılmıştır.

3.2.4.9. İstatiksel analizler

Gilaburu suyu örneklerde; fizikokimyasal, biyoaktif, mikrobiyoloijk ve duyusal özelliklerin örneklere ve depolama süresine göre değişimi, istatistiksel olarak saptanmıştır. Bu amaçla ANOVA testinden yararlanılmış ve ortalamalar arasındaki önemli bulunan farklılık çoklu karşılaştırma testi olan Duncan yöntemiyle belirlenmiştir (SAS, 2000).

4. BULGULAR

4.1. Piyasadan Toplanan Ve Kontrollü Şartlar Altında Fermente Edilen Gilaburu Suyu Örnekleri Sonuçları

4.1.1. Fizikokimyasal Analiz Sonuçları

Kayserinin farklı bölgelerinden toplanan taze gilaburu örneklerinin fizikokimyasal özellikleri Tablo 4.1’de verilmiştir. Tablo’da görüldüğü üzere taze örneklerin briks değerlerinin 8.30-9.90 arasında, indirgen şeker miktarları 62.82- 70.93 g/kg arasında, pH değerleri 3, toplam asitlik değerleri (laktik asit cinsinden) %2, protein miktarları 1 g/kg, kül değerleri %0.5, yağ miktarları kuru madde de %0.3 civarlarında ve ham selüloz miktarı ise %1’den düşük tespit edilmiştir. Etil alkol taze gilaburu örneklerinde beklenildiği gibi hiç tespit edilememiştir.

Tablo 4. 1.Kayserinin farklı bölgelerinden toplanan taze gilaburu örneklerinin fizikokimyasal özellikleri T: Taze gilaburu örnekleri, Asitlik: %, İndirgen Şeker: g/kg, Kül: %, Protein: g/kg, Ham selüloz: %, Yağ: %, Etil alkol: g/L

Kayseri’nin farklı bölgelerinden taze olarak toplanan ve laboratuar şartlarında 4 ay fermente edilen gilaburu örneklerinin fizikokimyasal özellikleri Tablo 4.2’ de gösterilmiştir. Fermente gilaburu örneklerinin briks, indirgen şeker ve pH değerlerinin taze örneklere biraz düşük olduğu belirlenmiştir. Bu düşüş, ortamda bulunan LAB’nin şekerleri kullanarak laktik aside dönüştürmesiyle açıklanabilir. Ancak fermente ürünlerdeki toplam asitliğin taze gilaburuya göre düşük olması, 4 ay gibi uzun bir süre devam eden karışık fermentasyonda, LAB tarafından oluşturulan laktik asit ile ortamdaki diğer organik asitlerin, fermentasyon ortamındaki mayalarca okside edilerek, buffer etkisi yapmasından kaynaklandığı düşünülmektedir. Yine kül, ham selüloz ve yağ miktarlarında kısmi bir azalma varken protein değerlerinde önemli ölçüde azalma olduğu tespit edilmiştir. Taze gilaburu örneklerinde

protein miktarları yaklaşık 1.5 g/kg düzeylerinde iken fermente örneklerde ise 0.5 g/kg düzeylerinde olduğu tespit edilmiştir. Bununla birlikte etil alkol miktarının 0.20-1.80 g/L arasında değiştiği saptanmıştır.

Tablo 4. 2. Kayserinin farklı bölgelerinden taze olarak toplanan ve laboratuar şartlarında fermente edilen gilaburu örneklerinin fizikokimyasal özellikleri

Örnek ^oBriks pH Asitlik F1-F10: Taze olarak temin edilip fermentasyona bırakılan gilaburu örnekleri, Asitlik: %, İndirgen Şeker: g/kg, Kül: %, Protein: g/kg, Ham selüloz: %, Yağ: %, Etil alkol: g/L

Kayseri’nin farklı bölgelerinden fermente edilmiş olarak toplanan gilaburu örneklerinin fizikokimyasal özellikleri Tablo 4.3’ te verilmiştir. Bu örneklerden elde edilen sonuçlar, laboratuar şartlarında fermente edilen örneklerin sonuçlarına benzer durumdadır. Bu örneklerin briks değerleri 7.60-10.0 arasında değiştiği saptanmıştır. pH değerleri benzerlik gösterirken tüm örneklerin toplam asitlik değerlerinin %2’nin altında olduğu saptanmıştır. Etil alkol değerleri incelendiğinde ise üç örneğin alkol miktarlarının 1 g/L’in üzerinde olduğu bulunmuştur.

Tablo 4. 3. Kayserinin farklı bölgelerinden fermente edilmiş olarak toplanan gilaburu örneklerinin fizikokimyasal özellikleri

Tablo 4. 4. Kayserinin farklı bölgelerinden toplanan taze gilaburu örneklerinin biyoaktif özellikleri T1 58.97±0.15 560.76±4.39 24.10±0.15 76.52±0.14 T2 56.40±0.22 542.42±4.24 18.88±0.27 73.85±0.44 T3 53.86±1.04 552.42±5.15 19.59±0.39 73.44±0.85 T4 53.40±1.26 516.29±4.92 20.92±0.39 71.98±0.48 T5 54.61±0.47 528.85±4.48 21.42±0.29 71.80±0.43 T6 50.82±1.24 512.58±5.30 19.32±0.27 72.93±0.20 T7 53.23±1.55 505.00±4.09 18.15±0.29 72.21±0.11 T8 49.00±0.98 500.83±4.92 19.39±0.30 72.84±0.56 T9 50.89±0.17 491.20±4.56 18.71±0.39 74.14±0.46 T10 59.82±1.08 579.71±4.53 21.26±0.38 76.45±0.33

T: Taze gilaburu örnekleri, Askorbik asit: mg/100 mL, Toplam fenolik: mg Gallik asit eşdeğeri (GAE)/100 mL, Antioksidan aktivite: mg Askorbik asit eşdeğeri (AAE)/mL, Antiradikal aktivite: % inhibisyon

4.1.2. Biyoaktif Özellikleri

Gilaburu örneklerinin biyoaktif özellikleri incelendiğinde (Tablo 4.4 ve 4.5) ise askorbik asidin 49-59.82 mg/100 mL arasında olduğu sadece bir örneğin 50 mg/100 mL’nin altında olduğu bulunmuştur. Antioksidan aktivitesinin 18.15-24.10 mg askorbik asit eşdeğeri (AAE)/mL arasında olduğu tespit edilmiştir. Antiradikal diğer bir ifade ile serbest radikal süpürme etkisinin %71.80 - 76.52 arasında olduğu belirlenmiştir. Bununla birlikte gilaburu örneklerindeki toplam fenolik içeriğinin yüksek olduğu bu değerlerin yaklaşık 491.20- 579.71 mg gallik asit eşdeğeri (GAE)/100 mL arasında olduğu tespit edilmiştir.

Tablo 4. 5. Kayserinin farklı bölgelerinden taze olarak toplanan ve laboratuar şartlarında fermente edilen gilaburu örneklerinin biyoaktif özellikleri

Örnek Askorbik F1 33.65±0.50 588.18±5.45 18.44±0.60 61.11±1.05 F2 31.45±0.78 578.95±5.91 15.22±0.39 58.29±0.89 F3 34.20±0.46 604.09±6.23 14.50±0.59 64.62±0.96 F4 33.49±0.55 558.50±6.18 14.20±0.26 63.21±0.97 F5 31.59±0.55 565.00±6.05 12.16±0.40 64.83±0.71 F6 31.82±0.84 553.50±5.00 15.16±0.25 61.66±0.33 F7 32.82±0.60 541.09±6.05 16.91±0.38 63.38±1.08 F8 28.66±0.78 540.14±6.82 15.48±0.39 63.66±0.86 F9 29.53±0.78 521.82±6.14 14.05±0.37 64.76±1.01 F10 35.30±0.73 608.50±5.59 18.05±0.34 70.95±0.95

F1-F10: Piyasadan toplanan fermente gilaburu örnekleri, Askorbik asit: mg/100 mL, Toplam fenolik: mg Gallik asit eşdeğeri (GAE)/100 mL, Antioksidan aktivite: mg Askorbik asit eşdeğeri (AAE)/mL, Antiradikal aktivite: % inhibisyon

Kayseri’nin farklı bölgelerinden taze olarak toplanan ve laboratuar şartlarında fermente edilen gilaburu örneklerinin biyoaktif özellikleri incelendiğinde ise, askorbik asit, antioksidan ve antiradikal aktivite değerlerinde fermentasyon sonucunda taze örneklere göre bir azalma meydana gelirken toplam fenolik madde miktarında ise bir artış olduğu belirlenmiştir.

Askorbik asit düzeyinde yüksek bir azalma (yaklaşık %40) meydana gelirken, antioksidan ve antiradikal aktivite değerlerinde azalış daha düşük düzeylerde olmuştur (Tablo 4.5).

Yine Kayserinin farklı bölgelerinden fermente edilmiş olarak toplanan gilaburu örneklerinin biyoaktif özellikleri de Tablo 4.6 ’da gösterilmiş olup, bu biyoaktif özellikleri de fizikokimyasal özelliklerinde olduğu gibi laboratuar şartlarında fermente edilen örneklere yakın bulunmuştur. Yine burada da toplam fenolik madde miktarının yüksek olduğu

Belgede Proje No: 110O214. Doç.Dr. Osman SAĞDIÇ Prof. Dr. Hasan YETİM Prof. Dr. Mehmet HAYTA Doç.Dr. Kemal SARIOĞLU Nurdan YAPAR (sayfa 37-0)