3. BULGULAR 48-
3.4. Gebeliğe Bağlı Değişiklikler
Geç diöstrus dönemi ile gebeliğin 15. günü kıyaslandığında Wnt genlerinden sadece Wnt8a ekspresyonun önemli ölçüde baskılandığı (P<0.05) Wnt4’ün ise arttığı gözlendi (P<0.06). Wnt2, Wnt2b, Wnt5a, Wnt5b, Wnt7a, Wnt9b, Wnt10b, Wnt11 Wnt16’nın ekspresyonları aynı dönem içerisinde değişmemiştir (Çizelge 3.1.).
Wnt genlerini inhibe eden SFRP1, SFRP2, SFRP5, Dkk1, Dkk2 ve Wif-1 ile hücre yüzeyi proteini olan FZD6 ve LRP6, sitoplazmik kompanentler DVL-2, GSK3-ß, ß-catenin, nükleus faktörü Lef-1 ve Wnt genlerinin uyardığı MSX2 genlerinde geç diöstrus ve 15. gün gebelik kıyaslandığında önemli bir değişiklik olmamıştır. Sadece Myc geni diöstruse göre (P<0,08) baskılandığı gözlendi (Çizelge 3.1.).
Luteolizisten sonra östrus ile gebeliğin 18. günü kıyaslandığında ise Wnt genlerinden Wnt7a’nın gebelikte baskılanmış (P<0,05), Wnt5a (P<0.08) ekspresyonu ve Wnt16 hafif artma göstermiş (P<0,09) diğer Wnt genlerinin (Wnt2, Wnt2b, Wnt4, Wnt5b, Wnt8a, Wnt9b, Wnt11, Wnt10b) ekspresyonu değişmemiştir (Çizelge 3.2.).
Wnt antagonistlerinden Dkk1 ve Wif-1 gebeliğe bağlı ekspresyonu artmış, SFRP1’inki ise azalmıştır (P<0,05). Diğer antagonistlerde (Dkk2, SFRP2, SFRP5)
değişiklik gözlenmemiştir. Wnt genlerinin hücre yüzey reseptörleri (FZD6 ve LRP6) ile sitoplazmik proteinlerin (DVL-2, GSK3-ß, ß-catenin) miktarları değişiklik göstermemiştir. Nükleer faktör Lef-1 ekspresyonu gebeliğe bağlı azalmasına rağmen Wnt genlerinin situmüle ettiği MSX2’in ekspresyonu gebeliğe bağlı artmıştır (P<0,05). Myc ise değişmemiştir (Çizelge 3.2.).
Çizelge 3.1. Geç luteolizis (LD) ile gebeliğin 15. günü (P15) karşılaştırıldığında Wnt genlerdeki ekspresyon seviyelerinin önem derecesini gösteren çizelge
LD P15 P değeri Wnt2 0,03948 0,02961 0,289 Wnt2b 0,05888 0,05096 0,549 Wnt4 0,00653 0,01303 0,059* Wnt5a 0,2144 0,2256 0,750 Wnt5b 0,004057 0,005207 0,267 Wnt7a 0,0003388 0,0001560 0,200 Wnt8a 0,0006442 0,0003184 0,02** Wnt9b 0,001851 0,002285 0,576 Wnt10b 0,00554 0,00332 0,117 Wnt11 0,04185 0,03505 0,245 Wnt16 0,002277 0,002420 0,886 SFRP-1 0,06696 0,0622 0,765 SFRP-2 0,00350 0,00629 0,301 SFRP-5 0,00385 0,00441 0,778 Dkk-1 0,2663 0,3411 0,420 Dkk-2 0,001508 0,001755 0,694 Wif-1 0,1112 0,2015 0,261 FZD6 0,0905 0,0748 0,636 LRP6 0,0964 0,1251 0,242 DVL-2 0,1450 0,2644 0,101 Gsk3-beta 0,2708 0,2145 0,420 Beta-catenin 1,424 3,297 0,108 Lef-1 0,1215 0,0967 0,341 Msx-2 0,2619 0,2957 0,664 Myc 0,03289 0,02455 0,078* *P<0.10 **P<0.05
Çizelge 3.2. Luteolizis sonrası östrus (AL) ile gebeliğin 18. günü (P18) karşılaştırıldığında Wnt genlerdeki ekspresyon değişiklerinşn önem derecesini gösteren çizelge
AL P18 P değeri Wnt2 0.03553 0.02012 0.234 Wnt2b 0.01564 0.03362 0.282 Wnt4 0.01389 0.01418 0.95 Wnt5a 0.0865 0.1911 0.08* Wnt5b 0.003305 0.002344 0.283 Wnt7a 0.004888 0.000693 0.035** Wnt8a 0.0008871 0.0006065 0.677 Wnt9b 0.000688 0.001784 0.424 Wnt10b 0.002308 0.00280 0.696 Wnt11 0.02203 0.04322 0.170 Wnt16 0.001152 0.00246 0.089* SFRP-1 0.2109 0.0593 0.021** SFRP-2 0.0099 0.00371 0.302 SFRP-5 0.002398 0.00401 0.365 Dkk-1 0.00332 0.17852 0.002** Dkk-2 0.001433 0.00174 0.728 Wif-1 0.00973 0.10830 0.001* FZD6 0.0727 0.0873 0.684 LRP6 0.1040 0.0973 0.787 DVL-2 0.1158 0.1566 0.420 Gsk3-beta 0.205 0.241 0.702 Beta-catenin 2.137 1.749 0.619 Lef-1 0.2450 0.0647 0.001** Msx-2 0.1490 0.3423 0.022** Myc 0.01965 0.0245 0.457 *P<0.10 **P<0.05
P22
Ov LD AL P15
L P18
250 bp
A
Resim 3.1: Wnt2’in A) PZR ürününün %2’lik agarose jelde görünümü, B) siklik ve C) gebe kısraklarda endometriumda Real-time PZR ile gösterilmesi.
P22
Ov LD AL P15
L P18
A
Resim 3.2.: Wnt2b’in A) PZR ürününün %2’lik agarose jelde görünümü, B) siklik ve C)
500 bp 250 bp
P22
Ov LD AL P15
L P18
A
Resim 3.3: Wnt4’ün A) PZR ürününün %2’lik agarose jelde görünümü, B) siklik ve C) gebe kısraklarda endometriumda Real-time PZR ile gösterilmesi.
500 bp
P22
Ov LD AL P15
L P18
A
Resim 3.4: Wnt5a’nın A) PZR ürününün %2’lik agarose jelde görünümü, B) siklik ve C)
500 bp 250 bp
P22
Ov LD AL P15
L P18
A
Resim 3.5: Wnt5b’nin A) PZR ürününün %2’lik agarose jelde görünümü, B) siklik ve C) gebe kısraklarda endometriumda Real-time PZR ile gösterilmesi.
500 bp 250 bp
P22
Ov LD AL P15
L P18
A)
Resim 3.6: Wnt7a’nın A) PZR ürününün %2’lik agarose jelde görünümü, B) siklik ve C) gebe kısraklarda endometriumda Real-time PZR ile gösterilmesi.
500 bp
P22
Ov LD AL P15
L P18
A
Resim 3.7: Wnt8a’nın A) PZR ürününün %2’lik agarose jelde görünümü, B) siklik ve C) gebe kısraklarda endometriumda Real-time PZR ile gösterilmesi.
500 bp 250 bp
P22
Ov LD AL P15
L P18
A
Resim 3.8: Wnt9b’nın A) PZR ürününün %2’lik agarose jelde görünümü, B) siklik ve C) gebe kısraklarda endometriumda Real-time PZR ile gösterilmesi.
500 bp 250 bp
P22
Ov LD AL P15
L P18
A
Resim 3.9: Wnt10b’nın A) PZR ürününün %2’lik agarose jelde görünümü, B) siklik ve C) gebe kısraklarda endometriumda Real-time PZR ile gösterilmesi.
500 bp 250 bp
P22
Ov LD AL P15
L P18
A
Resim 3.10: Wnt11’in A) PZR ürününün %2’lik agarose jelde görünümü, B) siklik ve C)
500 bp 250 bp
P22
Ov LD AL P15
L P18
A)
Resim 3.11: Wnt16’in A) PZR ürününün %2’lik agarose jelde görünümü, B) siklik ve C) gebe kısraklarda endometriumda Real-time PZR ile gösterilmesi.
500 bp 250 bp
P22
Ov LD AL P15
L P18
A)
Resim 3.12: SFRP-1’in A) PZR ürününün %2’lik agarose jelde görünümü, B) siklik ve C) gebe kısraklarda endometriumda Real-time PZR ile gösterilmesi.
500 bp 250 bp
P22
Ov LD AL P15
L P18
A
Resim 3.13: SFRP2’in A) PZR ürününün %2’lik agarose jelde görünümü, B) siklik ve C) gebe kısraklarda endometriumda Real-time PZR ile gösterilmesi.
500 bp 250 bp
P22
Ov LD AL P15
L P18
A
Resim 3.14: SFRP5’in A) PZR ürününün %2’lik agarose jelde görünümü, B) siklik ve C) gebe kısraklarda endometriumda Real-time PZR ile gösterilmesi.
500 bp 250 bp
P22
Ov LD AL P15
L P18
A
Resim 3.15: Dkk1’in A) PZR ürününün %2’lik agarose jelde görünümü, B) siklik ve C) gebe kısraklarda endometriumda Real-time PZR ile gösterilmesi.
500 bp 250 bp
P22
Ov LD AL P15
L P18
A
Resim 3.16: Dkk2’in A) PZR ürününün %2’lik agarose jelde görünümü, B) siklik ve C) gebe kısraklarda endometriumda Real-time PZR ile gösterilmesi.
500 bp
P22
Ov LD AL P15
L P18
A
Resim 3.17: Wif-1’in A) PZR ürününün %2’lik agarose jelde görünümü, B) siklik ve C) gebe kısraklarda endometriumda Real-time PZR ile gösterilmesi.
500 bp 250 bp
P22
Ov LD AL P15
L P18
A
Resim 3.18: FZD6’in A) PZR ürününün %2’lik agarose jelde görünümü, B) siklik ve C) gebe kısraklarda endometriumda Real-time PZR ile gösterilmesi.
500 bp 250 bp
P22
Ov LD AL P15
L P18
A
Resim 3.19: LRP6’in A) PZR ürününün %2’lik agarose jelde görünümü, B) siklik ve C) gebe kısraklarda endometriumda Real-time PZR ile gösterilmesi.
500 bp 250 bp
P22
Ov LD AL P15
L P18
A
Resim 3.20: DVL-2’in A) PZR ürününün %2’lik agarose jelde görünümü, B) siklik ve C) gebe kısraklarda endometriumda Real-time PZR ile gösterilmesi.
500 bp 250 bp
P22
Ov LD AL P15
L P18
A
Resim 3.21: GSK3-ß’nin A) PZR ürününün %2’lik agarose jelde görünümü, B) siklik ve C) gebe kısraklarda endometriumda Real-time PZR ile gösterilmesi.
500 bp
P22
Ov LD AL P15
L P18
A
Resim 3.22: ß-catenin’in A) PZR ürününün %2’lik agarose jelde görünümü, B) siklik ve C) gebe kısraklarda endometriumda Real-time PZR ile gösterilmesi.
P22
Ov LD AL P15
L P18
A
Resim 3.23: Lef-1’nin A) PZR ürününün %2’lik agarose jelde görünümü, B) siklik ve C) gebe kısraklarda endometriumda Real-time PZR ile gösterilmesi.
500 bp 250 bp
P22
Ov LD AL P15
L P18
A
Resim 3.24: Myc’nin A) PZR ürününün %2’lik agarose jelde görünümü, B) siklik ve C) gebe kısraklarda endometriumda Real-time PZR ile gösterilmesi.
500 bp 250 bp
P22
Ov LD AL P15
L P18
A
Resim 3.25: MSX2’nin A) PZR ürününün %2’lik agarose jelde görünümü, B) siklik ve C) gebe kısraklarda endometriumda Real-time PZR ile gösterilmesi.
500 bp 250 bp
4.TARTIŞMA
Çalışmada 10 adet kısraktan gebelik ve siklusun farklı günlerinde toplanan 24 adet biyopsi örneği kullanılmıştır. Siklus günleri plazma progesteron konsantrasyonu ve ultrasonografi ile endometrial ödem derecesi belirlenerek, gebelik günleri ise embriyo tespit edilerek gerçekleştirilmiştir.
Gebe kısraklarda biyopsi işlemi embriyonun uterustaki konumunun tespit edilmesinin ardından embriyoya en yakın yerden alınarak yapılmıştır. Bunun nedeni henüz implante olmamış ve kapsül yapısından dolayı uterus içerisine fazlaca yayılmamış olan kısrak embriyoları için endometriumda embriyonun varlığına bağlı oluşabilecek mRNA düzeyindeki ekspresyon farklılıklarının gösterilmesinde daha doğru sonuç vereceği düşünülmüştür. Nitekim; Haneda ve ark (2009) 25. günde gebe kısrak uterusunda gebe kornu ile gebe olmayan kornu arasında endometrial Interlökin-1 (IL-1) ekspresyonununda önemli ölçüde farklılıklar belirlemişlerdir. Siklik kısraklarda ise tüm endometrium aynı dönemlerde salgılanan maternal hormonların (progesteron, östrojen ve PGF2α) etkisinde olduğu için spesifik bir biyopsi yeri belirlenmesi ihtiyacı
duyulmamıştır.
Gebe ve siklik numunelerden total RNA’ların elde edilmesinde Fenol/Kloroform esasına dayanan Trizol yöntemi kullanılmıştır. Atlı ve ark (2009) beş farklı RNA izolasyon yöntemini karşılaştırdıkları çalışmada, Trizol yötemini ile oldukça iyi kalitede ve miktarda total RNA elde edildiğini bildirmektedirler. Sunulan çalışmada; Trizol yöntemi ile olgun mRNA’ların yanı sıra henüz yapım veya modifikasyon aşamasındaki mRNA’lar, ribozomal RNA’lar, yüksek moleküler ağırlıktaki RNA’lar, taşıyıcı RNA’lar ve daha küçük moleküler ağırlıktaki RNA’lar total RNA olarak ve bir kısım gDNA ile birlikte izole edilmiştir. Nükleusların da parçalanması ile henüz yapım aşamasındaki mRNA’ların da elde edilmesi sadece hücre içerisinde ömürleri kısa olan olgun mRNA elde edilmesi ile tespit edilecek gen ekspresyonundan daha güvenilir sonuç vermektedir (Farrell 2005).
RT-PZR ve/veya Real Time RT-PZR işlemlerinde, kontamine gDNA spesifik primer ile ürün oluşturduğu zaman mRNA’ların yanısıra gDNA’dan kaynaklanan miktar da ölçüleceğinden dolayı yanlış sonuçlar ortaya çıkarabilir (Farrell 2005). Çalışmadaki bazı genler için kullanılan spesifik primerler gDNA’yı templeyt olarak kullanmakta ve PZR ürünü oluşturmaktadır. Bu durumun önlenebilmesi için DNase I enzimi kullanılarak total RNA’dan gDNA kontaminasyonu temizlenmiştir. Daha sonra total RNA kullanılarak, gDNA kullanıldığında aynı büyüklükte ürün veren, GAPDH primerleri ile PZR yapılmış ve gDNA kontaminasyonuna bağlı GAPDH bantlarının oluşmamasıyla total RNA eldesinin gDNA yönünden temiz olduğu gösterilmiştir. Böylelikle çalışmada belirlenen ekspresyon farklıkları sadece RNA’dan kaynaklanmaktadır. Bu yöntemin RT işlemi esnasında gDNA varlığına bağlı kontaminasyonun gösterilmesi için kullanılan RT negatif reaksiyonu için alternatif olduğu söylenebilir.
Sunulan çalışmada RT reaksiyonu hem oligo dT hem de random hekzamer primerler kullanılarak gerçekleştirilmiştir. RT reaksiyonu, sadece mRNA için spesifik olan oligo dT primerlerinin yanında random hekzamer primerler ilave edilmesi sonucunda henüz poli-adenil ilave edilmemiş, modifikasyonun çeşitli aşamalarındaki mRNA’ların miktarının da ölçüme yansıtılmasından dolayı ekspresyon farklılıkların belirlenmesinde daha doğru sonuç vereceği düşünülmektedir.
Hem PZR hemde Real-time PZR için en uygun primerlerin belirlenmesi için birden fazla primer dizayn programı kullanılmıştır. Bu işlem sonrasında dizayn edilen primerlerin büyük bir bölümü hedef cDNA ile PZR’da primer dimer oluşturmamış, oluşturanlar ise erime eğrisi analizinde bakılarak primer dimer ürününün çoğaltılan bölgenin erime ısısı içerisine girmiyor olması sağlanmıştır. Ayrıca primer belirlenirken elde edilen primer çiftlerinin etkinliğinin (efficiency) %100 olabilmesi hedeflenmiştir ve bu amaçla mümkün olan en küçük PZR ürününü verebilecek primer çifti kullanılmıştır. Kısraklarda karakterize edilen Wnt gen ailesine ait sekanslar Gen Bankası üzerinde tahmin edilen sekans bilgisi olarak verildiğinden, primer dizayn programlarından elde edilen primerlerin ve gen bölgesinin BLAST programı ile kısrakta sadece ilgili bölgeyi
çoğaltıyor olması koşulu ile en az üç farklı türde de büyük benzerlikle aynı gen bölgesini çoğaltıyor olmasına önemle dikkat edilmiştir. Çoğaltılan RT-PZR ürünleri uygun restriksiyon endonükleaz enzimleri ile hem de gen bölgesinin DNA dizi analizi yapılması ile amaçlanan hedef gen olduğundan emin olunmuştur.
Touchdown PZR esnek bağlanma ısısı ile farklı Tm özelliğine sahip PZR primerlerinin aynı PZR protokollerinde çoğalmasına olanak sağlamaktadır. Dolayısı ile PZR analizlerinde farklı MgCl++ konsantrasyonlarının ve farklı bağlanma derecelerinin optimizasyonu için gradient PZR’ye olan gereksinim ortadan kalmaktadır (Don ve ark 1991). Sunulan çalışmada da genlerin tamamında 60–52 ˚C bağlanma ısı aralığı uygulanarak Touchdown PZR koşullarında araştırılan gen bölgelerinin çoğaldığı gözlenmiştir.
Real-time PZR işleminin normal PZR yöntemi ile kıyaslandığında avantajları; her siklus sonunda çoğaltılan hedef genin miktarını ölçülmesine fırsat tanıyan floresan özelliğinin olması ve PZR işlemi sonrasında agaroz jel elektroforezinde PZR ürünlerini yürütülüp daha sonra çekilen resimden piksel sayma özelliğine dayanan metotlara göre daha güvenilir olmasıdır. Zaten PZR’de 40 siklus sonunda tüpün içerisindeki ürün plato noktasında ulaştığı için, örnekler arasındaki ekspresyon farklılıklarının belirlenmesine dayanan piksel analizi yapılması çok sağlıklı olmamaktadır. Ayrıca her bir gen için ayrı ayrı siklus saysını belirlemek oldukça zaman alıcıdır ve Real-time PZR normal PZR’ye göre daha düşük templeyt cDNA miktarına ihtiyaç duymaktadır (Shipley 2007). Bu nedenle sunulan çalışmada farklı dönemlerde gen ekspresyon farklılıklarının gösterilmesi için Real-time PZR’den yararlanılmıştır.
Sunulan bu çalışma; kısrak endometriumda Wnt genleri, antagonistleri ile hücre içi sinyal iletimini sağlayan sistemdeki diğer bileşenlerin mRNA düzeyinde ekspresyonunu araştıran ilk çalışmadır. Wnt sinyal iletim sistemi; özellikle embriyonik dönemde doku ve organların farklılaşması ile embriyonik kök hücre çalışmalarında ve ayrıca sinyal iletim sistemine bağlı bozukluklar sonucu başta insanlarda olmak üzere birçok farklı türde ortaya çıkan çeşitli kanser ve malformasyon olgularında oldukça iyi
araştırılmış genlerdir (Clevers 2006, Nusse 2008b). Yine embriyonal dönemde reprodüktif doku ve organların gelişimi üzerine etkili olduğu knock-out (herhangi bir genin biyoteknolojik yöntemler kullanılarak genomdan silindiği) fareler üzerinde yapılan çalışmalar ile gösterilmiştir (Sassoon 1999). Özellikle yetişkin canlılarda endometriumda maternal ve/veya embriyonik kaynaklı hormonların etkisi ile siklus günleri içerisinde veya gebelik boyunca Wnt genlerinden bazılarının önemli değişiklikler göstermesi, büyüme faktörleri ailesinden olan bu genlerin endometriumda gebeliğin şekillenmesi, implantasyon, embriyonun büyüyüp beslenmesi gibi durumlarda diğer faktörler ile koordineli olarak rol aldığını göstermektedir (Sassoon 1999, Mohamed ve ark 2005, Hayashi ve ark 2007). Farelerde hem embriyonal dönemdeki uterus bezlerinin gelişimde hem de östrus siklusu boyunca Wnt genlerinin var olduğu gözlenmiştir (Miller ve ark 1998). Ayrıca gebelik boyunca uterusta ve blastosist aşamasındaki embriyoda varlıkları gösterilmiştir (Kemp ve ark 2005, Hayashi ve ark 2009). Koyunlarda bu genlerin neonatal dönem içerisinde ve erken gebelik süresince uterus ile embriyonun çeşitli bölgelerinde ekspresyonu saptanmıştır (Hayashi ve Spencer 2006, Hayashi ve ark 2007). İnsanlarda yine seksüel siklus içerisinde ve endometriozis olgularında Wnt sinyal iletim sistemine ait genlerin mRNA düzeyinde eksprese olduğu bilinmektedir (Tulac ve ark 2003, Tulac ve ark 2006, Gaetje ve ark 2007).
Mohammed ve ark (2005) Wnt sinyal iletim sisteminin farelerde implantasyonun gerçekleşmesi için gerekli olduğunu göstermişlerdir. Mericskay ve ark (2004) farelerde embriyonal dönemde uterus mezenşim dokusu ile epitel doku ilişkisi ve bezsel gelişimin Wnt genlerinin etkisi ile olduğunu açıklamışlardır. Ayrıca Hayashi ve ark (2009) yine fare uterusunda bu genlerin gebeliğin oluşumunda ve devam etmesinde rollerinin olduğunu göstermişlerdir. Tulac ve ark (2003) ise Wnt genlerinden bazılarının insanlarda menstürel siklusun proliferatif ve sekretorik fazında ekspresyonlarında değişmeler olduğunu bildirmektedirler. Hayashi ve Spencer (2006) neonatal kuzularda Wnt sinyal iletim sisteminin endometrial bezlerin gelişiminde önemli roller oynadığını açıklamışlardır. Yine aynı grup farklı bir çalışmalarında (Kim ve ark 2003) koyunların erken gebeliği süresince embriyonal kaynaklı IFN-τ’nun Wnt gen ekspresyonunu düzenlediğini vurgulamaktadırlar. Sunulan çalışmada; bazı Wnt genlerinin siklusa bağlı
ve bazılarının da hem siklus hem de gebeliğe bağlı olarak ekspresyon profillerinin değiştiğinin gösterilmesi bu genlerinde yukarıda anılan türlerde olduğu gibi kısraklarda da reprodüktif olayların oluşum sürecinde rollerinin olduğunu göstermektedir.
Wnt genleri bir büyüme faktörü gen ailesi olup hem embriyonal hayatta hem de yetişkin metabolizmasının düzenlenmesinde çok önemli görevler üstlenirler (Logan ve Nusse 2004). Wnt sinyal iletim sistemini aktive eden Wnt proteinlerinin hücre içerisindeki mekanizmaları ya ß-catenin üzerinden veya Ca2+/JNK üzerinden aktive ettiği bilinmektedir (Veeman ve ark. 2003, Logan ve Nusse 2004). Bunların dışında, trozin kinaz reseptörleri olan Ror2 ve RTK/Derailed ile Wnt proteinlerinin etkileştiği gösterilmiştir (van Amerongen ve ark 2008). Canonical sinyal iletim sisteminde Wnt proteinleri hücre membranında FZD ve LRP proteinleri ile etkileşime geçerek sitoplazma içerisindeki ß-catenin’in yıkımlanmasını engellemektedirler. Stabilize olan ß- catenin molekülü ise nükleus içerisine geçip DNA üzerindeki TCF proteinleri ile etkileşerek çeşitli genlerin aktivasyonu düzenler (Nusse, 2008a). Özellikle canonical yolun uyarılması yetişkin organizmalarda kanser oluşumunu tetiklemesinin yanı sıra, dokuların homeostazisi, hücrelerin farklılaşması ve proliferasyonunda rol oynadığı sanılmaktadır (Logan ve Nusse 2004). Non-canonical sinyal iletim sistemi ise ß- catenin’den bağımsızdır. Non-canonical Wnt’lerin ise hücrenin morfolojik özelliklerinin değişmesini ve hücre hareketlerini uyardığı bilinmektedir (Miller ve ark 1999). İnsanlarda östrus siklusunun farklı dönemlerinde Wnt2, Wnt3, Wnt4, Wnt5a, Wnt7a, Wnt8b, koyunlarda neonatal dönemde Wnt2, Wnt2b, Wnt4, Wnt5a, Wnt7a, Wnt11, erken gebelik döneminde neonatal döneme ek olarak Wnt5b, farelerde implantasyon döneminde Wnt4, Wnt5a, Wnt7a, Wnt7b, Wnt11, Wnt16, domuzlarda ise Wnt7a ve Wnt5a ekspresyonlarını saptanmıştır (Tulac ve ark 2003, Hayashi ve Spencer 2006, Hayashi ve ark 2007, Kiewisz ve ark 2008, Hayashi ve ark 2009) Sunulan çalışmada; canonical sinyal iletim yolunu aktive eden Wnt2, Wnt2b, Wnt7a, Wnt8a ile birlikte non- canonical sinyal iletim sistemini aktive eden Wnt5a, Wnt5b, Wnt11 ve Wnt16 proteinleri ve henüz tam anlamıyla klasifiye edilmeyen Wnt4, Wnt9b, Wnt10b’nin mRNA düzeyinde ekspresyonları kısrak endometriumunda östrus siklusunun ve erken gebeliğin araştırılan günleri boyunca belirlenmiştir. Diğer Wnt genlerinin ise (Wnt1,
Wnt3, Wnt6, Wnt7b, Wnt8b, Wnt14) araştırılan dönemlerde ekspresyonlarına rastlanılmamıştır.
Wnt genlerinin hedef dokulardaki etkilerini inhibe ettiği bilinen FZD reseptör proteinlerine benzeyen, fakat hücre içerisinde aktif domaini olmadığı için Wnt sinyal iletim sistemini inaktive eden SFRP ailesi, yine bu aileye mensup Wif–1 ve LRP proteinini inhibe ederek canonical yolu engelleyen Dkk1 başlıca spesifik antagonistlerdir (Logan ve Nusse 2004). İnsanlarda endometriumda frpHE ve Dkk1, koyunlarda erken gebelik boyunca sadece Dkk1, neonatal dönemde SFRP1, SFRP2, SFRP4 ve Dkk1’in ekprese olduğu belirlenmiştir (Tulac ve ark 2003, Hayashi ve Spencer 2006, Hayashi ve ark 2007). Sunulan çalışmada ise kısrak endometriumda araştırılan SFRP1, SFRP2, SFRP5, Wif–1, Dkk1 ve Dkk2’nin hem siklus günleri hem de gebelik günlerinde eksprese olduğu gözlenmiştir.
İnsanlarda (Tulac ve ark 2003) siklus içerisinde FZD6, LRP6, ß-catenin, DVL, GSK3ß, koyunlarda erken gebelik ve neonatal dönemde (Hayashi ve ark 2007) FZD6, FZD8, LRP5, LRP6, GSK3-ß, ß-catenin, e-catenin, Myc, MSX2, ve domuzlarda erken gebelikte (Kiewisz ve ark 2008) ß-catenin ve e-catenin’in eksprese olduğunu bildirilmektedir. Sunulan çalışmada siklik ve gebelik günlerinde araştırılan hücre yüzey reseptörü FZD6 ve LRP6, sitoplazma içerisinde DVL-2, ß-catenin, GSK-3ß, nükleus içi transkripsiyon faktörü Lef-1 ve Wnt uyarımları sonucunda aktive olduğu bilinen MSX2 ve Myc genlerininde kısrak endometriumunda varlığı gözlenmiştir.
Kısraklar diğer evcil hayvan türleri ile kıyaslandığında oldukça uzun bir süre (ortalama 7 gün) östrojenin etkisi altında östrus dönemi gösterirler. Ovulasyon genelde bu faz içerisinde gözlenir. Diöstrus döneminde ise başlıca hormon progesterondur (Jonhson ve Becker 1993). Aslında diöstrus dönemi embriyo için içerisinde gelişip büyüyeceği uterus ortamını hazırlar ve eğer kısrak tohumlanmış ve bununla birlikte uterus içerisinde sağlıklı bir embriyo varsa luteolizis oluşmadan diöstrus dönemi devam eder (Blanchard ve ark 1998). Kısrak endometriumu, siklus ve gebeliğin dönemlerine göre maternal olarak salgılanan hormonlar (östrojen, progesteron, lokal etkili hormonlar
gibi) ve embriyonik faktörler etkisi ile fizyolojik ve morfolojik özellikleri bakımından oldukça değişiklik göstermektedir (Gerstenberg ve ark 1999a, 1999b). Özellikle siklus süresince ovaryumdan salgılanan östrojenin etkisi ile endometrium katmanları bu dönemde oldukça belirginleşir ve ödemleşir (Atlı ve ark 2005). Bu dönemde büyüyen follikülden salgılan ve artan östrojenin etkisi ile endometriumun süperfisiyel katmanı, luminal epitel katmanı, bezlerdeki ve stratum kompaktum katındaki epitel hücreler oldukça proliferedirler (Gerstenberg ve ark 1999a). Östrus dönemindeki belirgin endometrial katlaşma ovulasyon zamanı yaklaştıkça östrojendeki düşüş ile birlikte azalır (Blanchard ve ark 1998). Ayrıca ovulasyon gününün belirlenmesinde kısraklarda ovulasyon gününde östrusa oranla azalan endometrial ödem derecesi kriter olarak kullanılmaktadır (Atlı ve ark 2005). Ovulasyon şekillenmesi ile birlikte kan plazma progesteron hormon miktarı da artmaya başlar (Daels ve Hugles 1993). Östrojenik etki altında iken artan proliferasyon ovulasyonun ardından hızlı bir şekilde düşüş gösterir (Gerstenberg ve ark 1999a). Kısraklarda diöstrus olarak tanımlanan dönem insan ve fare için sekretorik faz olarak anılmaktadır. Sekretorik dönemde derin glandular dokulardaki proliferasyon artar. Bu artış özellikle gebelik döneminde embriyonun beslenebilmesi için gerekli endometrial salgıların artışına sebep olur (Gerstenberg ve ark 1999a). Diğer hayvan türlerinde de özellikle sekretorik artışın embriyonun büyümesi ve yaşamını devam ettirmesi için gerektiği bildirilmiştir (Bartol ve ark 1999). Ayrıca insanlarda da gebeliğin ilk trimesterinde embriyonun büyümesi ve beslenebilmesi için uterus salgıların gerekliliği vurgulanmaktadır (Burton ve ark 2002). Kısraklarda gebelik döneminde ise 10. günden itibaren embriyodan salgılanan östrojenin de etkisi ile endometriumun bazı katmanlarında 14. günde artan proliferasyon 18. günde belirginleşir. Bu proliferasyonun embriyonun beslenip büyüyebilmesi için hücrelerden salgılarına devam etmesinde gereklidir (Gerstenberg ve ark 1999b). Endometrium içerisinde siklusun dönemleri veya gebeliğe bağlı olarak görülen hücresel değişimler esnasında bazı Wnt genlerinin ekspresyonlarının değiştiği diğer türlerde (Miller ve ark 1998, Tulac ve ark 2003, Hayashi ve ark 2007, Hayashi ve ark 2009) bildirilmiştir. Sunulan çalışmada kısrak endometriumda da bazı Wnt genlerinin ekspresyonlarının diğer türlerde olduğu (Miller ve ark 1998, Tulac ve ark 2003, Hayashi ve ark 2007, Satterfield ve ark 2008, Hayashi