Os testes de avaliação antimicrobiana foram realizados com colaboração do Prof. Dr. Pedro Luiz Rosalen do Departamento de Ciências Fisiológicas, Farmacologia, Anestesiologia e Terapêutica da Faculdade de Odontologia da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP).
A avaliação antimicrobiana foi composta por testes que utilizaram o micro-organismo em estado planctônico. Foram realizados os testes para determinação da CIM (concentração inibitória mínima) e CBM (concentração bactericida mínima). Tais ensaios foram aplicados à solução do peptídeo p1025 objetivando identificar a concentração ativa do peptídeo contra o
Streptococcus mutans.
Após a identificação da concentração ativa do peptídeo, esta foi incorporada na formulação F3-C e a avaliação antimicrobiana foi realizada por testes de inibição de formação
Materiais e Métodos
e queda de pH em biofilme, análises bioquímicas e microscopia eletrônica de varredura (MEV) para avaliação da integridade celular.
4.2.10.1 Preparo da suspensão bacteriana
O preparo da suspensão bacteriana foi feito de acordo com Koo e colaboradores (2000) e Duarte e colaboradores (2003). O micro-organismo Streptococcus mutans UA159, conservado em tanque de N2 (Container para nitrogênio líquido, modelo HCN-20, marca HEXICRYO), foi inicialmente reativado a partir da cultura original, cultivado em placas de BHI ágar, e incubado a 37 ºC, em atmosfera de 5% CO2, por 18-24 h. As colônias foram suspensas em solução de NaCl 0,89 % até atingir uma absorbância de aproximadamente 0,135 (660 nm), o que equivale a 1-2 x 108 Unidades Formadoras de Colônias/mL (UFC/mL).
4.2.10.2 Concentração Inibitória Mínima (CIM)
Os ensaios para a determinação da CIM do p1025 sobre o S. mutans UA 159 foram realizados através do método de microdiluição, utilizando microplacas estéreis de cultivo com 96 poços (Eloff, 1998). Solução aquosa do peptídeo de 1000 ug/mL foi diluída em BHI para obter concentrações finais na faixa de 5,0 a 500,0 μg/mL (v/v) em um volume final de 200,0 μL. O caldo BHI foi inoculado com suspensão bacteriana, conforme descrito no item 4.2.10.1, na proporção 1:1000, de modo a obter uma concentração bacteriana em torno de 1-2 x 105 UFC/mL, em seguida, incubadas em estufa à 37º C, atmosfera de 5% de CO2, por 24 horas. Após a incubação, foi feita a leitura final a 660 nm. A CIM é considerada a menor concentração em que não houver crescimento bacteriano, ou, uma leitura de absorbância menor que 0,05 em leitora monocanal de microplaca. O controle positivo foi o digluconato de clorexidina 0,12% e o controle negativo foi a água utilizada nas preparações.
4.2.10.3 Concentração bactericida mínima (CBM)
A determinação da CBM foi realizada conforme a metodologia descrita por Phillips e colaboradores (1991). Baseando-se nos resultados obtidos no teste da CIM, utilizaram-se como inóculos as suspensões provenientes dos poços que apresentam um resultado de leitura de absorbância a 660 nm, inferior a 0,05. Este inóculo (20 L) foi cultivado em BHI ágar com 5% de sangue de carneiro desfibrinado e incubadas em 5% de CO2, a 37º C, por 48 h. A
CBM foi considerada a menor concentração em que não houve crescimento celular sobre a superfície do ágar inoculado, ou seja, 99,9% de morte bacteriana.
4.2.10.4 Formação do biofilme
Os biofilmes de S. mutans foram formados em discos de hidroxiapatita (HA)
revestidos de saliva no interior de poços de microplacas contendo meio de cultura “Tryptone- Yeast Extract” (TYE, Difco®) adicionado de 1% de sacarose, incubados a 37 ºC, 5 % de CO2, por 5 dias, sendo o meio trocado a cada 24h. Todos os experimentos com biofilme, descritos a seguir, foram realizados em duplicatas de três experimentos independentes (KOO
et al., 2002).
4.2.10.5 Teste de inibição de formação do biofilme
Para este teste, durante o período de formação dos biofilmes de S. mutans, estes foram tratados duas vezes ao dia e até o quinto dia, com a formulação F3-CP com concentração de peptídeo 10 vezes superior à CIM e a formulação F3-C como controle negativo. Cada disco foi tratado por 1 minuto com F3-CP e F3-C, em seguida, o disco foi lavado com solução esterilizada de NaCl 0,9%, para evitar o efeito carry over, e transferido para um novo meio de cultura, até o 5º dia do experimento. Ao término do 5º dia de formação e tratamento dos biofilmes, estes foram sonicados, diluídos e cultivados para o procedimento de contagem microbiana (UFC/mL) e para análise de composição bioquímica de polissacarídeos e proteínas por métodos colorimétricos (KOO et al, 2008).
4.2.10.6 Teste de queda de pH em biofilme
Cada disco de HA contendo o biofilme formado (item 4.2.10.4) foi, após o 5º dia de formação, transferido para um tubo contendo NaCl 0,9% e, depois, foi adicionada a formulação F3-CP. O pH foi ajustado para 7,2 e em seguida, foi adicionado 1,5 mL de glicose a 1% (p/v) em cada tubo. Foram, então, realizadas medidas do pH, nos tempos de zero, 15, 30, 45, 60 e 120 minutos. Ao término desta fase experimental, cada disco foi lavado em solução estéril de NaCl 0,9% para remoção do composto e foi introduzido em um novo tubo contento solução de NaCl 0,9%, com o pH sendo novamente ajustado para 7,2 e a glicose novamente adicionada. Novas medidas de pH foram realizadas nos tempos de zero, 15, 30,
Materiais e Métodos
45, 60 e 120 minutos, para verificar se a formulação teste causou efeito irreversível sobre a produção de ácidos do micro-organismo em biofilme (BELLI et al., 1991).
4.2.10.7 Avaliação da integridade celular por microscopia eletrônica de varredura
(MEV)
Os biofilmes tratados com a formulação F3-CP e controles foram submetidos à análise de MEV para verificação de possíveis danos causados pelo peptídeo p1025 na estrutura celular do biofilme de S. mutans. Células provenientes dos biofilmes foram inoculadas em meio TSA e incubadas por 18h a 37º C. Em seguida, as células foram centrifugadas e a concentração ajustada para o equivalente a 0,5 da escala “McFarland”. A cada 9 mL da suspensão foi acrescentado 1 mL da fração ativa, em diferentes concentrações (sub-CIM e CIM). Após os tempos pré-determinados, as suspensões bacterianas foram centrifugadas e lavadas com glutaraldeído a 3% (v/v) em tampão fosfato (pH 7.4), por duas vezes e 2 mL de glutaraldeído foram adicionados ao “pellet” que permaneceu à temperatura ambiente por 12h. Novamente as amostras foram centrifugadas, o sobrenadante descartado e as células desidratadas com banhos sequenciais de etanol, nas concentrações de 50%, 70%, 90% e etanol absoluto (2x). Após secagem por 30 min à temperatura ambiente, foi determinado o ponto crítico. Na sequência foi feita metalização com ouro e as imagens observadas por MEV (5600LV) no aumento de 7000x (CHANDRA et al. 2001).
4.3 Análise estatística
Os dados obtidos nos diferentes experimentos foram avaliados pelo teste One-way ANOVA com pós-teste de Tukey com nível de significância de 0,01 %. As análises foram executadas através do software Graph Pad Prisma, versão 5.01, 2007.