Gaz Kromatografisi (GC)

Gaz kromaografisi (GC) bitkilerdeki terpenler gibi uçucu ve termal olarak dayanıklı bileşenlerin analizinde sıklıkla tercih edilen bir analitik ayırma yöntemidir. Sıvı kromatografisi yöntemleri ise polar ve az-polar bileşenlerin analizinde tercih sebebidir. Gaz kromatografisinde diğer kromatografi türlerinde olduğu gibi ayrılmaları istenen maddelerle hareketli faz arasında herhangi bir etkileşim söz konusu değildir. Hareketli faz olarak He, Ar ve N2 gibi inert gazlar kullanılır ve vazifesi maddeleri

sürüklemektir. Gaz halindeki analitler ise uçuculuklarına göre farklı hızlarda ilerleyerek dedektöre ulaşırlar. Bitkilerin uçucu (esansiyel) yağlarının kompozisyonu çoğunlukla gaz kromatografisi yöntemleri kullanılarak analiz edilir. Ayrıca yağ asitleri gibi uçucu olmayan bileşenler de türevlendirilerek uçucu hale getirilip GC yöntemleri ile analiz edilirler.

72

Şekil 2.34. Gaz kromatografi cihazının şematik gösterimi

Gaz kromatografisinde, gaz halindeki bir mobil faz yine gaz halinde olan analitleri sabit faz içeren ince ve uzun bir kolon boyunca taşır. Yukarıdaki şekilde (Şekil 2.34) görüldüğü gibi, uçucu olan bir nümune kendisini buharlaştıracak olan ısıtılan bir blok üzerinden enjekte edilir. Nümune kolon boyunca He, Ar, N2,veya H2 gibi bir mobil

faz aracılığıyla kolon boyunca sürüklenir ve ayrılan analitler, çıktısının bir bilgisayar üzerinde görüntülendiği dedektöre doğru akarlar.

Taşıyıcı gaz kimyasal olarak inert olmalıdır. Gaz seçimi genellikle kullanılan dedektöre göre değişkenlik gösterir. Ayrıca, taşıyıcı gaz sistemi su ve diğer safsızlıkların sisteme ulaşmaması için bir moleküler elek içerir. Optimum kolon etkinliği için enjekte edilen numune miktarı çok olmamalı ve hızlı bir şekilde kolona buhar olarak gitmelidir. Fazla miktardaki nümunenin yavaş enjeksiyonu bant genişlemesine ve çözünürlüğün azalmasına yola açar. En çok kullanılan enjeksiyon metodu, nümuneyi kauçuk bir septum üzerinden kolonun hemen başında bulunan hızlı buharlaştırıcıya enjekte edildiği metottur.

Gaz kromatografisinde açık boru (tabular) veya kapiler kolonlar ve dolgulu (packed) kolonlar olarak iki tip kolon kullanılır (Şekil 2.35). Kapiler kolonlar, kapiler tüpten (0.3-0.5 mm iç çap) yapılmış ve içi 1 mikro litre kadar kalınlıkta sıvı ile

73

kaplanmış kolonlardır. Kapiler kolonlardaki basınç düşüşü ihmal edilebilir düzeyde olduğundan bu tip kolonlar çok uzundur (10-100 m veya daha fazla). Dolgulu kolonlar iç çapı 1-8 mm aralığındaki cam veya metal tüplerden yapılır; uzunlukları 2-20 m olabilir. Bunlar katlanmış veya sarımlar şeklindedir, böylece termostat içine sığabilecek boyutlara getirilmişlerdir.

Şekil 2.35. Dolgulu ve kapiler kolon tipleri

Gaz kromatografisinde kullanılabilen birçok dedektör tipi mevcuttur. Her dedektör farklı bir seçicilik sunar. Kütle spektrometre (MS), alev iyonlaştırma (FID), ısıl iletkenlik (TCD), elektron yakalama (ECD), Azot-fosfor, alev fotometrik (FPD), foto-iyonizasyon (PID) ve Hall elektrolitik iletkenlik dedektörleri en çok kullanılan dedektörlerdir. Bitki sekonder metabolitlerinin kalitatif ve kantitatif analizlerinde is en çok kütle spektrometre (MS) ve alev iyonlaştırma (FID) dedektörleri kullanılır. Uçucu (esansiyel) yağların tayininde GC-MS, yağ asitleri tayininde ise GC-FID ve GC-MS cihazları kullanılır.

2.5.3. HPLC teknikleri

Kromatografik analitik tekniklerin birçoğunda, nümune içindeki farklı bileşenlerin fiziko-kimyasal özelliklerindaki farklılıklara göre ayrım gerçekleştirilir. Genellikle, analitlerin ayrımdan hemen sonra (on-line) dedekte edildiği sürekli (continuous) teknikler kullanılır. Bu tekniklerin en çok kullanılanı HPLC (yüksek performanslı sıvı kromatografisi) tekniğidir.

Sıvı kromatografisi, numune bileşenlerinin bir sıvı mobil faz ve bir katı durgun faz (yüksek yüzey alanına sahip küçük gözenekli partiküller içeren) arasında dağıldığı bir ayrım tekniğidir. GC’nin aksine HPLC’de durgun fazla güçlü bir şekilde etkileşen numune molekülleri kromatografik sistem boyunca daha uzun sürelerde dolaşır ve daha

74

uzun alıkonma zamanına sahip olurlar. LC (sıvı kromatografi) ayrımında, hareketli (mobil) faz pompadan kromatografik kolona doğru aspire edilir. Numunenin kolona girmesiyle, analitler durgun fazda farklı oranlarda zaman geçirir ve iki faz arasında farklı oranlarda dağılım gösterirler. Kolonun sonundan elüe olan her bir analit dedektöre ulaşır ve bir şekilde ölçülebilir olan bir sinyal üretirler. Oluşan sinyalin intensite ve süresi analitin miktarı ve doğasıyla alakalıdır. Genel olarak, sinyal amplifiye edilir (yükseltilir) ve elektronik bir entegratör (analiti tanımlayıp miktarını tayin etmek için kromatogram üreten bir bilgisayar) tarafından kaydedilir.

HPLC ekipmanı marka ve modelden bağımsız olarak bir dizi önemli kısımları içerir: pompa, enjektör, kromatografik kolon, termostatlı kolon fırını, dedektör ve veri toplama sistemi. HPLC cihazının temel ekipman şeması Şekil 2.36’de gösterilmiştir.

Şekil 2.36. Temel HPLC ekipman şeması

Geleneksel olarak, LC kolonlarının (durgun faz) oldukça polar (silika v.b.) ve hareketli fazın apolar (hegzan v.b.) olduğu moda “normal-faz” sıvı kromatografisi denir. Bu modda analitlerin polariteleri arttıkça alıkonma zamanları artar. Eğer mobil fazın polaritesi artırılırsa alıkonma zamanı azalır. Bu kromatografik mod, apolar veya az polar flavonoid aglikonlarının ayrımı için kullanışlı olabilir.

Günümüzde ise analitlerin analitik ve preperatif ayrımları için en çok kullanılan teknik “ters-faz” sıvı kromatografisidir. Bu teknikte, hareketli faz durgun fazdan daha polar olup analitlerin elüsyon sırasını belirler. Hidrofobik moleküller için daha uzun

75

olan alıkonma zamanı, hareketli faza daha apolar çözgenler ekledikçe azalır. Numune moleküllerinin hidrofobikliği pH’a bağlı olduğu için, formik asit, asetik asit ve trifloroasetik asit gibi maddeler hareketli faza eklenebilir. Asit eklemenin etkisi uygulamaya göre değişir ancak genellikle ayrımı olumlu yönde etkiler (Perrin and Dempsey 1974; Snyder and Kirkland 1997).

Bitkilerin biyoaktif sekonder metabolitlerinin birçoğu polar karakterli olduğu için, C8 (n-oktil) veya daha çok C18 (n-oktadesil) gibi hidrokarbonlarla modifiye edilmiş

kolonların kullanıldığı ters faz kromatografisi ile ayrılırlar. Elüsyon ise asetonitril veya metanol gibi polar organik çözücülerin su ile beraber olduğu mobil fazlar ile gerçekleştirilir.

HPLC kolonlarında, küçük ve aynı boyutlardaki partiküllere sahip dolgu materyalinin kullanılması sonucu gelen daha iyi seçicilik ve yüksek basınçlı akış, hem daha yüksek ayırma gücü hem de daha hızlı analizlere olanak sağlamıştır. Son zamanlarda UHPLC (ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi) tekniğinin ortaya çıkmasıyla sıvı kromatografisinde büyük gelişmeler olmuştur. Bu teknik sayesinde, 2 μm veya daha küçük boyuttaki partikül boyutu ve çok yüksek basınçlarda (1300 bara kadar) çalışan pompa sistemleri ile daha kısa analiz süresi, yüksek pik etkinliği ve yüksek ayrım gücüne ulaşılır (Zotou 2012).

2.5.3.1. HPLC ile beraber kullanılan dedektörler

HPLC cihazına UV dedektör, Diod-array dedektör (DAD), Refraktif indeks dedektörü (RID), Floresan dedektör, Elektirik iletkenlik dedektörü, Elektrokimyasal dedektör, Buharlaştırmalı ışık saçılımlı dedektör (ELSD), ve kütle spektrometre (MS) dedektörü gibi farklı tipte dedektörler bağlanıp kullanılmaktadır (Skoog ve ark. 1996). Bununla birlikte fitokimyasalların kalitatif ve kantitatif analizlerinde UV-visible ve MS dedeksiyon sistemleri günümüzde HPLC ile birlikte en çok kullanılanlardır.

UV-visible temelli dedektörler, kolondan gelen hareketli fazın içerisinden aktığı küçük bir sıvı akış hücresi içerirler. UV ışık hücrenin içinden geçer ve UV foto- dedektöre çarpar. UV absorbans dedektörleri nümuneyi bozmazlar ve sadece ışık kaynağının dalga boyundaki radyasyonu absorbe eden maddelere karşı cevap verebilirler. İki farklı türde dalgaboyu dedektörü vardır: sabit ve çoklu dalgaboyu dedektörleri. İlki ışın dalgaboyunun değiştirilmesine izin vermezken, diğeri analiti

76

belirlemek için kısa bir dalgaboyu aralığını tarayabilir. Çoklu dalgaboyu dedektörlerinin hassasiyeti sabit dalgaboyululara göre daha kötü olmasına karşın esneklik avantajı vardır. Çözelti içerisindeki birçok bileşik elektromanyetik spektrumun UV-visible bölgesindeki ışığı absorplayabilir. Bu yüzden bu dedektörler evrensel dedektörler olarak düşünülebilir. UV-görünür bölge spektroskopisi bize molekül yapısı hakkında bilgi veremez ve belli bir desen olmayınca tam olarak bir aydınlatma sağlayamaz. Ancak bize bileşiklerin bağlı oladuğu sınıflar hakkında bigi verir. Zira her molekül sınıfının karakteristik absorpsiyon bantları vardır. Bu yüzden, kütle spektrometresi gibi tekniklere ihtiyaç vardır.