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Na última versão do UniProtKB utilizada no presente trabalho de fevereiro de 2012, havia o surpreendente número de aproximadamente 17 milhões de seqüências completas de diversos genomas. Enquanto isso, bancos de dados de homólogos como COG [4], KEGG Orthology [17] e OMA [7, 54] disponibilizam uma porção desse universo protéico contida no genoma completo de algumas centenas de organismos. SeedServer é um ferramenta desenvolvida com o intuito de abranger todas as seqüências completas depositadas no UniProtKB em uma busca direcionada ao interesse do usuário.

A ferramenta possui um programa principal responsável por coordenar seus diversos módulos constituintes. Os módulos Seed Linkage e UEKO demonstraram a importante função de incluir com eficiência seqüências provenientes de genomas incompletos ou em processo de montagem em todos os exemplos estudados, chegando a uma contribuição superior a 50% do total de proteínas. No entanto, mesmo com os exigentes parâmetros de recrutamento, a inclusão de alguns poucos candidatos espúrios pode ainda ser observada. Tais inclusões puderam ser detectadas e filtradas do recrutamento SeedServer final através do módulo de validação escolhido, baseado em matrizes PSI-BLAST, cuja composição é controlada pela própria seqüência Seed de interesse fundadora do agrupamento.

A correlação entre validação PSI-BLAST e a nomenclatura EC esperada foi aferida, demonstrando uma alta taxa de acerto entre seqüências SwissProt curadas manualmente, de 99,72%. Embora não esperado, a mesma proporção de verdadeiros positivos foi encontrada utilizando-se além das entradas SwissProt, as entradas que receberam anotação automática na base TrEMBL. Adicionalmente, uma segunda correlação com famílias PANTHER foi utilizada. Mais uma vez, foi observado um

bom desempenho no nível de família PANTHER, onde 86,94% das proteínas associadas aos termos que possuíam descrições especificadas estavam de acordo com o esperado para cada caso. Já para o nível mais específico de subfamílias, esse mesmo índice foi de 91,04%. A alta similaridade entre proteínas que desempenham funções diferentes é um aspecto que inevitavelmente leva ao erro, entretanto a similaridade elevada possivelmente denota origem comum e proximidade evolutiva.

Também é possível haver manutenção da função biológica com alta similaridade da estrutura secundária ainda que haja uma baixa conservação da seqüência primária por acúmulo de mutações a partir de um ancestral comum. No entanto, esses casos fogem ao objetivo desse trabalho que utiliza métricas de comparação de estrutura secundária (SOV) como parâmetro complementar à inferência de homologia e não como princípio para tal finalidade, como realizado por outros métodos [55] e organizado por bases de dados como a SCOP [56]. Assim, depois de utilizar em vários estudos de caso o parâmetro SOV, preferimos não recomendar um limiar de corte para determinar homologia, mas preservamos a sua exposição no relatório de resultados por ser uma forma de inferir similaridade estrutural. A presença e a manutenção de elementos estruturais como alfa-hélices ou folhas beta são contra- intuitivamente naturais em seqüências randômicas de aminoácidos [57], no entanto parece improvável que a conservação da estrutura como um todo e a ordem dos elementos, refletida no parâmetro SOV seja por mero acaso. Assim, valores altos são uma informação adicional relevante.

Ao analisarmos milhares de comparações estruturais provenientes dos diversos experimentos realizados, porcentagens de aproximadamente 70% de valores SOV foram observadas entre homólogos separados nos três diferentes super-reinos da vida (eucariotos, procariotos e archaeas) enquanto entre homólogos de mesmo

gênero essa taxa foi de aproximadamente 90%. No entanto, estudos com outros programas para prever estrutura secundária, ou com dados extraídos de estruturas resolvidas, são necessários para comprovação desses dados preliminares. Uma atenção especial deve ser dada nesse tipo de estudo para proteínas multifuncionais bem como entre homólogos de organismos multiplóides ou com diversos parálogos como as plantas. Esta evidência de menor similaridade estrutural entre parálogos sustenta a teoria denominada “Conjectura do Ortólogo” [58] onde ortólogos são mais conservados que parálogos, um conceito refutado por Nehrt et al. [59], mas cada vez mais comprovado experimentalmente [60–63].

Uma interface web foi desenvolvida para utilização do SeedServer oferecendo um serviço estável para processos de poucas dezenas de Seeds, sendo remendada instalação local para trabalhos mais abrangentes através do guia de instalação fornecido. A limitação de Seeds pertencentes à base de dados UniProtKB sendo negado o uso de seqüências próprias dos usuários se justifica pela inviabilidade de conferência dos dados como atribuição de taxonomia adequada. Esse aspecto, no entanto não se mostrou uma limitação nos diversos exemplos apresentados nesse trabalho. A ferramenta conta com o uso do serviço computacional baseado em web

services BOWS, que permitirá a transposição do processamento SeedServer entre

diferentes servidores com capacidade de alto processamento, mantendo a estrutura básica web criada.

O Seedserver mostrou-se uma plataforma eficaz para estudos de inferência do surgimento de genes e vias através da determinação do LCA [45] bem como de deleções gênicas. Nosso grupo mostrou em um estudo de caso um quadro atualizado de uma Grande Deleção Genômica de diversas enzimas envolvidas na biossíntese de alguns aminoácidos em grupos de eucariotos e procariotos [64], inicialmente

discutido para dez eucariotos de genomas completos por Payne e Loomis [31]. A esta deleção se segue a perda da capacidade assimiladora de nitrogênio, componente essencial na formação dos aminoácidos, demonstrando que genes com funções supérfluas em um metabolismo tendem ser eliminados na evolução, fato evidenciado pela compactação dos genomas de organismos parasíticos. Em contrapartida, proteínas mantidas em um genoma pertencentes a vias funcionalmente incompletas demonstraram uma maior susceptibilidade ao acúmulo de mutações o que pode levar a sub ou neo-funcionalização das mesmas. A inclusão controlada de seqüências fragmentadas nesse estudo mostrou potencial para agregar informação, sendo uma meta a atualização da ferramenta SeedServer para lidar com as mesmas. Todavia, as seqüências agrupadas podem ser prontamente descarregáveis pelo usuário e utilizadas para esse fim por método análogo ao utilizado por nosso grupo.

Uma vez que uma das funções de um grupo de homólogos é a inferência da função de genes desconhecidos associados a outros de função descrita, quanto maior o número de seqüências anotadas, melhor será a qualidade desse processo. Um exemplo recente mostra a inferência de possíveis patógenos de espécies do gênero

Candida através da propagação de termos funcionais de Candida albicans [65].

Hoje em dia, a atribuição de termos Gene Ontology (GO) por grupos como o Gene

Ontology Annotation (GOA) através de métodos manuais ou computacionais é uma

importante fonte de anotação de propriedades biológicas às proteínas. No entanto, a representatividade desses bancos de dados é enviesada para alguns grupos de organismos modelo e funções escolhidas previamente [25]. No sentido de expandir essa anotação para organismos próximos aos anotados atualmente foi criada a ferramenta U-MAGE baseada em matrizes de recobrimento de grupos UniRef50. A

metodologia atual de criação de grupos UniRef50 exige um recobrimento de 80% entre recrutadas e proteína representativa do grupo, porém esse filtro não elimina a presença de seqüências com menos da metade do tamanho da representativa quando são advindas de grupos UniRef100, fato que justifica o custo operacional de geração das matrizes. Inicialmente somente termos de uma das três hierarquias presentes no GO foram escolhidos, os de “Função Molecular”, por apresentarem alta conservação entre homólogos [60], porém futuramente as outras hierarquias como Componente Celular também poderão ser incluídas. A melhoria quantitativa (número de proteínas que adquirem termos GO) e qualitativa (número de termos GO mais específicos na hierarquia que foram adicionados) poderá auxiliar em estudos de caracterização das funções presentes em determinadas amostragens com maior suporte obtido por métodos estatísticos [24, 66]. A propagação automática de termos menos específicos das hierarquias GO entre homólogos já demonstrou alta eficácia em um experimento com quatro eucariotos [67] sendo que a ferramenta U-MAGE poderá servir como uma plataforma para propagação manual de termos GO mais específicos e uma vez estabelecidos parâmetros e limites de qualidade, subsidiar uma melhor propagação automática. Essa automação já demonstrou rivalizar em qualidade com anotações manuais [68].

Uma vez que o U-MAGE se restringe às seqüências homólogas altamente similares, futuramente é possível uma interação com o SeedServer para expandir os limites da propagação a homólogos mais distantes. Ambas as ferramentas desenvolvidas nesse trabalho contribuem na propagação da informação biológica disponível para proteínas conhecidas, representando uma contribuição à Bioinformática.