O sistema de análise seminal auxiliado por computador é formado por um microscópio ótico binocular com contraste de fase acoplado a uma câmera de vídeo e placa aquecedora, conectados a um computador que utiliza o software SCA. Este programa provê os meios para uma classificação objetiva e rápida, de uma determinada população de espermatozóides. Usando imagens digitais da trajetória de cada célula espermática, o CASA pode analisar, processando algoritmos, as propriedades de movimento dos espermatozóides (Verstegen et al., 2002).
O sistema é simples, envolve uma câmara filmadora que grava o movimento através do videomicroscópio e depois recomeça a seqüência quadro a quadro enquanto marca a posição de cada espermatozóide em um tempo determinado para assim poder calcular as velocidades e a motilidade. Este programa é muito utilizado para avaliação de sêmen humano em clínicas de fertilidade, também sendo muito utilizado para mamíferos, mas que para peixes teve que ser adaptado pelo tempo de movimento, que é de menos de 2 minutos, comparado às varias horas do sêmen de mamíferos (Kime et al., 2001).
Os parâmetros do CASA que são geralmente informados incluem:
MOT (%): percentual de espermatozóides móveis ou progressivos, determinando os que têm movimento rápido, movimento médio e os localmente móveis ou lentos.
VCL (µm/seg): velocidade curvilinear, que é a velocidade do movimento ao longo da trajetória (Fig. 5).
VSL (µm/seg): velocidade em linha reta, velocidade do movimento a partir do ponto inicial até o ponto final ao longo de uma linha reta teórica unindo os dois pontos.
VAP (µm/seg): é a velocidade média do caminho.
LIN (%): linearidade, que é a proporção entre a VSL e a VCL (VSL/VCL) e indica que o maior valor da reta é o caminho mais linear dos espermatozóides.
STR (%) (straightness): índice de espermatozóides na reta.
ALH (µm/seg): deslocamento lateral da cabeça.
Figura 5. Representação esquemática das diferentes velocidades medidas pelo sistema de análise seminal (CASA). VCL= velocidade curvilinear; VSL= velocidade em linha reta; VAP = velocidade média.
Alguns estudos foram realizados em peixes utilizando o sistema CASA para registrar o movimento dos espermatozóides depois do processo de criopreservação, um destes é o de Liu et al. (2007), onde avaliaram a motilidade e a velocidade do sêmen fresco e descongelado do Pagrus major 10 segundos pós-ativação. Os autores encontraram 87% de motilidade no sêmen fresco e 82% no sêmen congelado com DMSO a 10%, não existindo diferença significativa entre a velocidade do sêmen descongelado e o sêmen fresco.
Dreando et al. (1997), analisaram no CASA a motilidade do sêmen pré e pós- descongelamento do peixe plano Scophthalmus maximus, onde os melhores resultados (60 e 80% de motilidade) foram obtidos quando se diluiu Mounib modificado (KHCO3, sacarose e glutationa) em BSA ou DMSO a 10%, enquanto a
velocidade permaneceu estável entre o sêmen puro e o descongelado.
Outros estudos se apóiam no programa para observar características do sêmen “in natura” ou para testar outros fatores que influenciam a velocidade e o movimento do sêmen. Dietrich et al. (2005), investigaram os efeitos seqüenciais do sêmen coletado post mortem e depois da anestesia da truta arco íris (Oncorhynchus mykiss), percebendo uma diminuição nos parâmetros de motilidade, velocidade e trajetória. Wilson e Ingerman (2007) obtiveram no peixe zebra (Danio rerio) motilidades de 83%, VCL de 104 µm/s, VAP de 77 µm/s, VSL de 77 µm/s e LIN de 84 µm/s ativado com água da torneira.
Cada processo de congelamento é espécie-específico, por isso é preciso ter informações sobre as particularidades do sêmen da espécie objetivo e de diversas espécies de peixes (volume coletado, motilidade, concentração de espermatozóides, pH e osmolaridade), o que permite padronizar as técnicas, definir os componentes crioprotetores e os meios diluentes a testar, bem como os procedimentos adequados para o congelamento e posterior descongelamento dos espermatozóides (Carneiro, 2007). Também é importante conhecer as morfoanomalias do sêmen antes e depois de ser congelado, já que estas representam o estado dos gametas no momento do congelamento e os criodanos causados por este processo.
Ainda existem muitas questões básicas a serem respondidas no tocante às técnicas de conservação de sêmen de muitas espécies tropicais de interesse econômico e ambiental. Alguns dos objetivos essenciais da criopreservação são alcançar taxas de fertilização próximas às obtidas com sêmen fresco, avaliar criodiluentes que diminuam os efeitos tóxicos, estresse osmótico e criodanos sobre a célula espermática (alterações na membrana do espermatozóide e em seu DNA) e conseguir curvas de congelamento e descongelamento benéficas para os espermatozóides (Deandro et al., 1997; Suquet et al., 2000; Medina et al., 2005). Portanto, é importante a continua e progressiva pesquisa com crioprotetores, já que eles são adicionados ao meio para proteger os gametas durante o processo de criopreservação e descongelamento, sendo fundamentais para evitar a formação de cristais de gelo intracelular que causariam o rompimento da célula (Medeiros et al., 2002). Entretanto, altas concentrações de crioprotetores são deletérias aos espermatozóides devido a sua toxicidade, o qual pode resultar na redução da motilidade. Igualmente os meios diluentes devem ser adicionados aos crioprotetores, já que os mesmos prolongam a vida dos espermatozóides in vitro, reduzindo a atividade metabólica, seja por inibidores químicos ou por redução de temperatura (Cloud, 2000).
A geração de um protocolo de criopreservação do sêmen da espécie Piaractus brachypomus (pirapitinga), contribuirá não só para suprir a demanda da espécie como também trará vantagens ao aqüicultor e ao meio ambiente, devido a seguintes
itens: i) redução ou eliminação de reprodutores (machos) mantidos na Estação experimental, com conseqüente redução de custos; ii) eliminação da assincronia da atividade reprodutiva entre reprodutores, quando estes não estão preparados simultaneamente para a reprodução; iii) utilização de um volume total de sêmen, quando são indivíduos que produzem pouco em cativeiro; iv) disponibilidade de sêmen fora da temporada de desova; e v) diminuição da pressão sobre as populações silvestres (Godinho, 2000).