A indústria do caju é uma das principais fontes de renda e trabalho no meio rural, e representa a maior parcela da economia do nordeste brasileiro (MOREIRA et al., 2013). No Brasil, a cajucultura mobiliza cerca de 280 mil pessoas e possui uma área cultivada de 740.000 ha (OLIVEIRA, 2008). Para permanecer no ranking mundial de produtores de castanha, liderados pela Índia e Vietnã, a cajucultura brasileira tem buscado alternativas para otimizar sua produção (FBB, 2010). Neste contexto, o uso de clones de cajueiro anão desempenha interessantes contribuições, conferindo maior quantidade de castanhas por área
plantada, além de características nutricionais que favorecem o consumo dos seus pedúnculos (CAJUNOR, 2013).
Plantas de cajueiro podem ser afetadas por várias doenças, que limitam o sistema de produção agrícola (FREIRE et al., 2002; ADENIYI et al., 2011). Dentre elas, a resinose causada pelo fungo Lasiodiplodia theobromae (Pat.) Griffon & Maubl. é considerada a principal doença do cajueiro nas condições semiáridas do nordeste brasileiro. L. theobromae infecta o caule levando à redução no transporte de água e nutrientes, com consequente diminuição da fotossíntese e, eventualmente, a morte da planta (MUNIZ et al., 2011). Nenhuma medida prática de controle da resinose, além da resistência genética, provou ser eficaz em situações epidêmicas. Além disso, a expansão da área cultivada com o clone suscetível CCP 76, associado com a descoberta de fontes primárias do inóculo, obtidas a partir de sementes e mudas assintomáticas, tem contribuído para o surgimento de surtos graves da doença (CARDOSO et al., 2009a; CARDOSO, 2010).
Estudos foram realizados para avaliar características ultraestruturais de infecção com L. theobromae (MUNIZ et al., 2011), o efeito de diferentes combinações de enxerto e porta- enxerto sobre a incidência de resinose (CARDOSO et al., 2010) e seleção de genótipos resistentes (MOREIRA et al., 2013;. PAIVA et al., 2008). No entanto, não existem dados publicados sobre as respostas fisiológicas e bioquímicas de plantas de cajueiro infectadas por L. theobromae.
Nós últimos anos, a análise de proteomas tem sido empregada com sucesso para monitorar respostas moleculares do hospedeiro ao desafio de patógeno (MANDELC et al., 2013). A capacidade das plantas de se defenderem contra pragas e doenças está associada a uma série de proteínas que podem diferencialmente reprogramadas (GERBER et al., 2008; YANG et al., 2011; AFROZ et al., 2011). Uma vez que o proteoma representa a contribuição efetiva das proteínas expressas para a função celular (MEHTA et al., 2008), a comparação com base no perfil de expressão é necessária para obter uma compreensão mais completa dos mecanismos envolvidos, e quais alterações são mais importantes na defesa das plantas (ZIMARO et al., 2011).
Em nosso grupo de pesquisa, um estudo comparativo de mapas proteicos dos clones CCP 76 (sadio e doente) e BRS 226 (sadio e doente), coletados em campo, permitiu a identificação de um conjunto de 80 proteínas que compõem o proteoma do cajueiro, assim como, de proteínas diferencialmente expressas entre os grupos sadio e doente de cada clone. Em tal
estudo, um protocolo eficiente para elaboração de mapas bidimensionais de caules de cajueiro foi desenvolvido, possibilitando a identificação de uma variedade de proteínas relacionadas à defesa nos clones doentes (GONDIM, 2010).
Como os eventos moleculares de defesa associados à interação do cajueiro infectado com L. theobromae permanecem desconhecidos, em especial, no que se refere a marcadores proteicos de defesa, no presente estudo, a expressão de proteínas que possivelmente justifiquem a condição de resistência/suscetibilidade foi explorada. Para tal proposito, foi realizada análise proteômica diferencial de caules do clone BRS 226 (padrão comercial de resistência), em tempos iniciais após inoculação com o fungo, e de plantas de cajueiro comuns classificadas como resistentes e suscetíveis à resinose, em condições de campo com alta pressão do patógeno.
Assim, esse estudo foi conduzido na perspectiva de identificar proteínas do caule de cajueiro que são reprogramadas em resposta à infecção pelo L. theobromae e associá-las aos mecanismos biológicos responsivos à presença do patógeno. Embora todo esse processo seja bastante complexo, é esperado que esse estudo permita construir um conjunto de resultados que possam ser, futuramente, integrados a programas de melhoramento genético do cajueiro visando a geração, alicerçada em fundamentos bioquímicos, de novos genótipos resistentes à resinose.
2. HIPÓTESE E OBJETIVOS
2.1 Hipótese
A resistência das plantas de cajueiro à infecção pelo fitopatógeno L. theobromae tem como base a expressão diferencial de proteínas no caule envolvidas em alterações bioquímicas e fisiológicas responsáveis pelo estabelecimento dessa relação de incompatibilidade entre o fungo e a planta.
2.2 Objetivos
2.2.1 Objetivo Geral
Identificar proteínas diferencialmente expressas em caules de cajueiro do clone BRS 226, infectados pelo fungo Lasiodiplodia theobromae, bem como em caules de plantas suscetíveis e resistentes à resinose, em condições de campo.
2.2.2 Objetivos Específicos
Extrair proteínas do tecido caulinar do clone BRS 226 (resistente), assim como de caules de plantas resistentes e suscetíveis à resinose, em condições de campo;
Obter mapas bidimensionais com alta qualidade e reprodutibilidade das proteínas extraídas dos caules de cajueiro;
Analisar os perfis bidimensionais obtidos de caules de cajueiro via programa PDQuest 8.0.1 (Bio-Rad Laboratories);
Identificar, por Espectrometria de Massas, as proteínas diferencialmente expressas nos caules de cajueiro, após a infecção com L. theobromae;
Analisar a atividade de enzimas envolvidas com estresse oxidativo, metabolismo secundário e PR-proteínas, em caules de plantas resistentes e suscetíveis à resinose.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Reagentes
Coomassie Brilhante Blue G-250, solução Fenol saturado com Tris, pH 8,0, polivinilpolipirrolidona (PVPP), β-mercaptoetanol (2-ME), acrilamida e bis-acrilamida foram obtidos da Sigma-Aldrich, Brasil. 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propane sulfonate (CHAPS), Ditiotreitol (DTT), Fluoreto de Fenilmetil sulfonil (PMSF), iodoacetamida, óleo mineral, tiouréia, uréia, tiras para focalização isoelétrica pH 3-10, , IPG buffer 3 -10, dodecil sulfato de sódio (SDS) foram obtidos da GE Healthcare, Brasil. Ácido Tricloroacético (TCA) e ácido trifluoracético (TFA), ambos possuindo grau analítico, foram obtidos de diferentes fornecedores. A enzima tripsina foi adquirida da Promega, Madison, WI, USA.
Os demais reagentes utilizados, de grau analítico, foram obtidos, comercialmente, de diferentes fornecedores.
3.2 Materiais biológicos
3.2.1 Lasiodiplodia theobromae
O fungo L. theobromae utilizado nos experimentos foi previamente isolado de plantas de cajueiro infectadas e situadas no município de Palhano-CE. Este fungo corresponde ao isolado número 103 utilizado em testes de patogenicidade e pertence à Micoteca do Laboratório de Fitopatologia da Embrapa Agroindústria Tropical, Fortaleza-CE. O fungo foi mantido em meio de cultura batata-dextrose-ágar (BDA), que estimula a esporulação, e incubado por 72 horas a 25 ± 1 ºC, com fotoperíodo de 12 horas claro/escuro.
3.2.2 Clones de cajueiro BRS 226 e CCP 76
Os clones de cajueiro utilizados neste estudo foram preparados sob condições de viveiro na estação experimental da Embrapa Agroindústria Tropical, Pacajus-CE. Plantas dos clones BRS 226 e CCP 76 foram enxertadas sobre o mesmo porta-enxerto, obtido de plântulas do clone CCP 06 (SOUZA e ARAÚJO, 2001). Noventa dias pós-enxertia, as mudas foram
transportadas para a casa de vegetação do Laboratório de Fitopatologia da EMBRAPA (Fortaleza - CE), onde permaneceram em condições de aclimatação durante 10 dias, com radiação fotossinteticamente ativa (PAR) de 700 µm m−2s−1, temperatura média de 25 ºC noite/ 35 ºC dia, umidade relativa de 30 - 70% e irrigação via aspersão com 8,60 mm de água/planta.
3.2.3 Plantas de cajueiro resistentes e suscetíveis à resinose, em condições de campo Para este estudo, foram utilizadas, também, plantas adultas classificadas como resistentes e suscetíveis, em condições de campo, com aproximadamente 2 anos de idade. Estas plantas fazem parte de uma população de cajueiro, estabelecida a partir da polinização aberta do clone BRS 226, que foram cultivadas na Fazenda Planalto, pertencente à Companhia Industrial de Óleos do Nordeste (CIONE), localizada na BR 020, km 4, município de Pio IX-Piauí. As coordenadas geográficas da Fazenda são: latitude de 6° 34‟ e 24,5” S; longitude de 40° 50‟ e 39” W; altitude de 730 m; temperatura média de 24 ºC (18 - 36 ºC) e a pluviosidade média de 609,7 mm.