3 MATERYAL METHOD
4.2 Enzim Aktivitelerinin Karşılaştırılması;
Bir ay boyunca tartılan deneklerin vücut ağırlıklarındaki artış, hipokampus, serebral korteks, serebellum dokularındaki SOD, CAT, GSH-Px enzim aktiviteleri ve NO, MDA değerleri karşılaştırılarak tablolar halinde verildi (Tablo 8-10). Kontrol (19,50±5,57) ve prolpolis gruplarında (6,37±5,23a) doku artışı gözlenmişken alkol grubunda doku ağırlığında
negatif yönde azalış gözlenmiş olup (8,25±5,1) alkol+propolis grubunda (1,62±2,46) bu azalış alkol grubuna göre daha az olmuştur (Tablo 8).
Tablo 8: Grupların vücut ağırlık kaybı ve hipokampus dokusunda enzim değerleri ile MDA ve NO miktarları (Ortalama ± Standart Sapma).
a; p < 0,05 grup 1 ile karşılaştırıldığında, b; p < 0,05 grup 2 ile karşılaştırıldığında, c; p < 0,05 grup 3 ile karşılaştırıldığında,
Tablo 9: Grupların korteks dokusunda enzim sonuçları, ile NO ve MDA değerleri (Ortalama ± Standart Sapma).
a; p < 0,05 grup 1 ile karşılaştırıldığında, b; p < 0,05 grup 2 ile karşılaştırıldığında,
Gruplar (n=8) VA % gr SOD U/mg protein CAT K/g protein GSH-Px U7Mg protein MDA nmol/g doku NO Nmol/g doku 1 Kontrol 19,50±5,57 114,4±3,53 0,15±0,02 3,2±0,2 1,98±0,1 1,08±0,3 2 Propolis 6,37±5,23a, 148±9,10a, 0,13±0,02 4,5±0,3a 2,03±0,3 1,29±0,3 3 Etanol 8,25±5,1a,b 121,3±4,33b 0,15±0,01 3,9±0,3 2,28±0,1 2,28±0,7 4 Etanol+ Propolis 1,62±2,46 150,6±19,13 0,13±0,01 3,8±0,4b 1,53±0,2 c 1,18±0,3 Gruplar (n=8) SOD U/mg protein CAT K/g protein GSH-Px U7Mg protein MDA nmol/g doku NO Nmol/g doku 1 Kontrol 109,3±3,3 0,15±0,02 2,79±0,2 1,77±0,14 1,18±0,21 2 Propolis 143,3±5,9a 0,18±0,04 2,39±0,1 1,61±0,12 1,15±0,30 3 Etanol 121,7±4,5a,b 0,10±0,01 2,09±0,1a 1,72±0,09 1,59±0,35 4 Etanol+Propolis 115,4±10,8 0,13±0,01 1,67±0,2a,b 1,84±0,13 1,62±0,31
c; p < 0,05 grup 3 ile karşılaştırıldığında,
Tablo 10: Grupların ve serebellum dokusunda enzim sonuçları, MDA ve NO miktarları (Ortalama ± Standart Sapma).
a; p < 0,05 grup 1 ile karşılaştırıldığında, b; p < 0,05 grup 2 ile karşılaştırıldığında, c; p < 0,05 grup 3 ile karşılaştırıldığında,
5. TARTIŞMA
Günümüzde keyif verici ve sakinleştirici olarak kullanılan alkolün tüketiminde; stresli şehir hayatı, yoğun mesailer ve psikolojik sebeplere bağlı olarak artış görülmektedir. Bu nedenle alkol birçok araştırma projesine konu olmuş, alkolün canlı organizma üzerine yaptığı hasarlar ve bu hasarlara karşı olası koruyucu maddeler araştırılmıştır. Alkolün merkezi sinir sistemine olan etkisi ise son yıllarda araştırıcıların ilgisini çeken bir konudur. Daha önceden yapılmış olan çalışmalar bu konuda yetersiz kaldığından dolayı son yapılan çalışmalar alkolün, özellikle beyinin öğrenme merkezlerinde oluşturduğu hasarın araştırılmasına yöneliktir.
İnsanlarda ve hayvanlarda yapılmış olan çalışmalar sonucunda; kognitif proseslerin hipokampusta şekillendiği, alkolün hipokampal formasyonu hasarlayarak öğrenme ve bellek oluşumunu engellediği açığa çıkarılmıştır. Alkolün, öğrenme ve bellekte oluşturduğu bu
Gruplar (n=8) SOD U/mg protein CAT K/g protein GSH-Px U/Mg protein MDA nmol/g doku NO Nmol/g doku 1 Kontrol 91,14±4,4 0,29±0,02 1,6±0,09 1,9±0,07 1,0±0,1 2 Propolis 104,6±12,8 0,20±0,02a, 2,0±0,32 1,8±0,15 0,8±0,1 3 Etanol 89,1±8,34 0,21±0,02a, 1,5±0,18 1,8±0,14 0,7±0,2 4 Etanol+Propolis 107,4±10,8 0,31±0,03b,c 1,8±0,25 1,3±0,17a,b,c 0,9±0,1
hasarların merkezi sinir sisteminin her bölgesinde yaygın bir baskı üretmesinden ileri geldiği bildirilmiştir (3,23,37-39,41).
Alkol; beyin-sinir-hücre haberleşme sisteminde seçici özelliğe sahiptir. Etkileşimde olduğu hedeflerin reseptör-iyonofor komplekslerinin sadece belirli alt tiplerinde etkilidir (16). GABA’nın GABAA tipi reseptörlerini indirekt olarak aktive eder, klorür kanallarının açılmasını kolaylaştırır böylece nöronlarda hiperpolarizasyon oluşturarak hücrelerin uyarılabilirliğini zayıflatır (31).
Öğrenme ve belleğin şekillenmesinde bir model olan LTP iki sinir hücresi arasındaki bağların uzun süreli olarak güçlendirilmesidir (13). NMDA reseptörleri LTP’ın anahtarı olup alkol tarafından aşırı decede uyarılırlar. NMDA reseptörlerindeki bu aşırı uyarılma sonucunda içeriye fazla miktarda Ca++ girer ve nöronlarda ölüme neden olarak kognitif fonksiyonları hasarlar (16,31).
Alkolün öğrenme üzerinde oluşturduğu hasarın nedenlerinden birininde alkol metabolizması sonucunda açığa çıkan serbest radikallerin oluşturduğu oksidatif hasardan kaynaklandığı bilinmektedir (4,57). Alkol birçok dokuda lipit peroksidasyonuna neden olmasının yanı sıra, metabolizması sonucu açığa çıkan oksijen ve NO radikalleri, asetaldehit artışı gibi etkileriyle hücre içi redoks durumunu belirgin olarak değiştirmektedir (4,5,49). Bunlara ek olarak asetaldehidin metabolize olamadığı bu nedenle serbest radikallerin oluşmasına sebep olduğu, bütün bunların sonucu olarak alkol toksitesinin ve oluşturduğu hasarın arttığı bilinmektedir (4,57).
Propolis, günlük yaşantımızda sıkça besin maddesi olarak kullandığımız balın hammaddesi olup arıların çeşitli bitkilerden topladıkları polenlerden oluşturdukları bir maddedir. Kanser, tümör oluşumu, ülser gibi birçok hastalığa karşı koruyucu rolü araştırılmış, olumlu sonuçlar elde edilmiştir (8,9). Anti-bakteriyel, anti-fungal, anti-enflamatuar, anti-kanserojen, anti- oksidan, immunostümülatör gibi birçok özelliğe sahiptir (8-13).
Porpolisin antioksidan özelliği alkolden kaynaklanan sebest radikallerin oluşumunu önleyerek, bu radikalleri süpürücü etki yapabilmektedir. Birçok araştırmaya konu olmuş propolisin antioksidan özelliğinin, içerdiği flavonoidlerden kaynaklandığı belirtilmiştir (7,10,11,79). Flavonoidlerin aktif bir bileşeni olan CAPE’nin lipooksijenaz aktivitesini inhibe ettiği ve dokularda ROS ile indüklenen lipit peroksidasyonunu baskıladığı
bildirilmiştir (80). Fenolik bileşiklerin bu antioksidan etkilerinin; lipit peroksidasyonu sırasında oluşan lipitlerin polimer zincir reaksiyonlarını kırarak, ROS’un dokulardan uzaklaştırılmasını sağlamasından ileri geldiği belirtilmiştir (81).
Literatürde bizim çalışmamıza benzerlik gösteren tek araştırma; alkolün öğrenme üzerinde oluşturduğu hasarlara karşı propolisin polifenolik bir bileşeni olan quercetinin uygulanıp sonuçlarının artı labirentte değerlendirildiği bir çalışmadır (82). Yapılan araştırma sonucunda alkolün öğrenme ve bellekte oluşturduğu bozuklukları quercetininin tersine çevirebildiği ve kronik olarak uygulanan quercetininin kronik alkol uygulamasına bağlı olarak artan oksidatif hasarı önleyebildiği rapor edilmiştir (82). Bizim çalışmamızın sonuçları da literatürdeki bu çalışmayla paralellik göstermektedir.
Araştırmamızda öğrenme ve belleğin değerlendirilebilmesi için literatürde belirtilen T- labirent düzeneğini kullandık (83). Çalışma sonucunda elde edilen; grupların T-labirentteki bazal süreleri, sakınma 1, sakınma 2 ve şartsız korku değerleri tablo 4-7’de verildi. Sakınma 2 ve şartsız korku değerleri gruplar arasında farklı olmakla birlikte istatistiksel olarak anlamlı bulunamadı.
Grupların T-labirentteki bazal süreleri değerlendirildiğinde 6. günde yapılan testte sadece propolis ve alkol+propolis grupları arasında istatistiksel olarak fark bulunmuştur (Tablo 5). Gruplar arasında 11. günde fark bulunmazken, 30. günde kontrol ile propolis + alkolgrupları arasında ve propolis ile propolis + alkol grupları arasında istatistiksel açıdan fark vardır (Tablo 6-7).
Grupların T-labirentteki sakınma 1 değerleri incelendiğinde sadece 11. günde kontrol grubu ile alkol grubu arasında ve kontrol grubu ile alkol + propolis grubu arasında istatistiki açıdan anlamlı bir fark bulunmuştur.
Gruplar arasında sakınma 2 ve şartsız korku değerleri arasında fark olmakla birlikte bu fark istatistiksel olarak önemli değildir.
Şekil 13- 16 ve tablo 4-7 incelendiğinde alkolün akut dönemde (0-11 güne kadar ) hasarlayıcı etkisinin istatistiksel olarak önemli olmadığı, kronik dönemde (11. günden sonra) gruplar arasında belirgin farklar oluştuğu bunların bazılarının istatistiksel olarak anlamlı olduğu görülmektedir (Tablo 4-7). Bu sonuçlar literatürde yapılmış olan çalışmaların sonuçları ile paralellik göstermektedir (82). T- labirent testin sonucunda; bazal süre, sakınma
1, sakınma 2 gibi şartlı korkuyu (öğrenilmiş korkuyu ) ifade eden parametrelerin sürelerinde azalma gözlenmesi, şartsız korku süresinin artması alkolün öğrenme ve kısa süreli bellek üzerinde olumsuz etkilere sahip olduğunun bir göstergesidir. Bu bilgilere dayanarak alkolün kognitif süreci ilgilendiren beyin bölgelerinde hasarlara yol açtığını söyleyebilirz. Oluşan bu hasarın moleküler düzeyde hangi mekanizmalardan kaynaklandığı konusunda bir yorum yapabilmek için beyinin farklı bölgelerinde antioksidan sistemleri karşılaştırdık.
Oksidatif stres; metabolik prosesler sonucunda açığa çıkan serbest radikallerin miktarının artmasına bağlı olarak antioksidant sistemlerin yetersiz kalması ile oluşur (47, 50, 82). Alkol doymamış yağ asitleri üzerine etki ederek lipit peroksidasyonunun ilerlemesine neden olur (4,49,82). Daha önceden yapılmış olan çalışmalada labirent sonuçları ile beyindeki oksidatif hasar arasında ilişki olduğu bulunmuştur (82). Bu nedenle T- labirentteki sonuçlarımızı antioksidan sistemlerden elde edilecek bilgilerle karşılaştırabilmek için SOD, CAT, GSH-Px gibi antioksidan enzim aktivitelerini ve NO,MDA gibi antioksidan madde düzeylerini gruplar arasında karşılaştırdık.
Serbest radikallerin doymamış yağ asitlerine saldırısı sırasında üretilen aldehitlerden biri de MDA (malon di aldehid) tir. TBARS (Thiobarbituric acid reactive substances) ile girdiği reaksiyon sonucu verdiği renk ile varlığı saptanır (84). Dokularda oluşan süperoksid radikali (O2-), SOD (Süperoksid dismutaz) enzimi tarafından hemen H2O2 ve oksijene dönüştürülür (47, 84). Diğer antioksidan enzimler olan CAT (katalaz) ve GSH-Px (Glutatyon peroksidaz) H2O2’nin suya ve oksijene dönüşümünü sağlar (84). Hücrelerde temel strateji SOD, CAT, GSH-Px, kullanılarak O2- ve H2O2’i detoksifiye etmek ve daha toksik ürünlerin oluşumunu önlemektir (49). Beyinde önemli bir radikal kaynağı da nitrik oksit aracılığı ile açığa çıkmaktadır. NO normalde toksik olmayıp iskemi sırasında nitrik asit, reperfüzfon sırasında hidroksil radikali benzeri reaktif ürünlerin oluşumuna neden olur (46).
Çalışmamızda propolis grubunun hipokampus ve korteks dokusundaki SOD ve GSH-Px düzeyleri kontrol gurubuna göre istatistiki olarak anlamlı düzeyde artmıştır (P<0,05). Sonuçlar litaratürde belirtilen propolisin kronik kullanımına bağlı olarak antioksidan özellik gösterdiği sonucuyla örtüşmektedir (79, 80-82). Alkolün kognitif fonksiyonlarda oluşturduğu hasarları tersine çevirmede propolis; oluşan toksik bileşikleri süpürücü etki yapması, DNA da oluşan bozuklukları azaltıcı etkiye sahip olması, lipit peroksidasyonunu önlemesi gibi antioksidan özelliklerinden dolayı etkilidir.
Literatürde yapılmış olan çalışmalarda kronik alkol uygulaması; lipit peroksidasyonunu arttırmış, SOD, CAT, GSH-Px enzim seviyelerini azaltmış olup kronik olarak propolisin polifenolik bir bileşeni olan quercetinin bunu tersine çevirdiği bildirilmiştir (82). Alkolün beyinde oluşturduğu hasarın incelendiği bir başka çalışmada; kronik alkol uygulamasının hipokampus dokusundaki SOD ve GSH-Px enzim aktivitelerini değiştirmezken MDA düzeyini attırdığı, serebral korteksin de dahil olduğu diğer beyin bölgelerinde SOD ve GSH- Px enzim aktivitelerini azaltırken MDA düzeyinde değişime neden olmadığı belirtilmiştir (85).
Hipokampus, serebral korteks ve serebellum dokularındaki SOD, GSH-Px enzim aktiviteleri gruplar arasında karşılaştırıldığında; grup 3’teki (alkol) enzim aktivitesinin grup 1 (kontrol) ve grup 2 (propolis) deki enzim aktivitelerinden daha az olduğu, grup 4’teki (propolis + alkol) enzim aktivitesinin ise grup 3’e oranla arttığı gözlenmiştir (Tablo 8-10). Fakat bunlardan sadece hipokampus ve serebral korteks dokusundaki enzim değişmeleri istatistiksel olarak anlamlı iken serebellum dokusundaki enzim değişimleri istatistiksel olarak anlamlı bulunamamıştır. Bu sonuçlar literatürde yapılmış olan çalışmalardaki sonuçlarla paralellik göstermekdir (52,82,85). Bu durum alkolin ve propolisin etkisinin farklı beyin bölgelerinde farklı olduğunun bir kanıtı olabilir. Alkol metabolizasyonu sonucunda açığa çıkan asetaldehit gibi alkol metabolitleri dokular için oldukça toksiktir. Bu metabolitler kognitif fonksiyonların oluştuğu beyin bölgelerinde oksidatif hasarlara neden olmakta böylece öğrenme ve bellekte bozukluklar oluşmaktadır. Propolis dokularda oluşan toksik metabolitleri süpürücü, lipit peroksidasyonu zincirlerini kırıcı etkiye sahiptir. Bu özelliğindendir ki alkolle indüklenen oksidatif hasarı tersine çevirebilmektedir.
Lipit peroksidasyonun indikatörü olan TBARS kronik alkol kullanımına bağlı olarak artmakta olup bu alkolün oluşturduğu oksidatif stresin bir sonucudur (4,49,82,85). Yaptığımız araştırmada MDA miktarı ölçülmüş olup; hipokampus ve serebellum dokularında alkolle oluşan lipit peroksidasyonundaki artış kronik propolis uygulaması sonucunda azalmış olup bu azalma istatistiki olarak anlamlıdır (Tablo 8-10). Buna karşın gruplar arasında serebral kortekste MDA sonuçları açısından anlamlı bir fark bulunamamıştır. Çalışma sonunda lipit peroksidasyonu açısından elde ettiğimiz bilgiler daha önce yapılmış olan çalışmaların sonuçları ile aynı doğrultudadır (82, 85). Sonuç olarak alkol, beyinin kognitif fonksiyonlarının gerçekleştiği alanlarda lipit peroksidasyonunda bir artışa neden olarak oksidatif hasarlar oluşturur. Propolis ise içerdiği bileşenlerden kaynaklanan antioksidan
özellikte olup, lipitlerin polimer zincir reaksiyonlarını kırarak lipit peroksidasyonunu önler. Bu nedenle alkolün oluşturduğu hasarlara karşı bir koruyucu olarak kullanılabilir.
Beyin dokularındaki CAT enzim aktivitesi ölçüldüğünde; hipokampus ve serebral korteks dokusunda anlamlı bir değişiklik belirlenememiştir. Serebellum dokusunda propolis grubunun CAT aktivitesi kontrol grubuna göre anlamlı olarak artmış, alkol grubunun CAT aktivitesi kontrole göre anlamlı olarak azalmış, propolis + alkol grubunun CAT aktivitesi alkol ve propolis grubuna göre anlamlı ölçüde artmıştır.
Literatürde araştırmamıza benzerlik gösteren sadece iki çalışma olmakla birlikte her ikisinde de NO düzeyleri incelenmemiştir (82, 85). Hipokampus, serebellum, serebral korteks dokularında NO düzeylerinin ölçülmesi sonucunda gruplar arasında istatistiki açıdan fark bulunamamıştır. Bunun nedeninin; normal şartlarda beyin üzerinde toksik bir etki göstermeyen NO’nun (46) uyguladığımız modeldeki alkol konsantrasyonunun beyin dokusunda toksik etki yapacak düzeye ulaşamamış olmasından kaynakalandığını düşünmekteyiz. Modeldeki alkol konsantrasyonunu ve uygulama süresini arttırılarak yapılacak bir çalışmada NO seviyesinde de anlamlı değişiklikler oluşturacağı kanaatindeyiz.
Bütün bu veriler ışığında, alkolün beyinin farklı bölgelerinde farklı sonuçlar oluşturması ile birlikte beyin dokusunda oksidatif bir hasar oluşturduğunu söylemek mümkündür. Bu hasar, alkol metabolitlerinin beyin dokularında toksik etki yaparak oksidatif hasara yol açması, beyinin kognitif fonksiyonlarının oluştuğu alanlarda lipit peroksidasyonunu arttırması, kognitif fonksiyonların işleyişinde önemli yere sahip olan glutamat ve GABAerjik reseptörlerde aşırı uyarılmaya neden olması gibi etkilerinden ileri gelmektedir. Propolis oksidatif hasara yol açan metabolitleri süpürücü etkiye sahip olmasının yanı sıra lipit peroksidasyonunu polimer zincir reaksiyonu kırarak önler. Bundan dolayı alkolün beyin bölgelerinde oluşturduğu hasarlara karşı propolisin koruyucu özellik gösterdiğini düşünmekteyiz. Alkolle indüklenen oksidatif stresin beyinin farklı bölgelerinde farklı sonuçlar vermesi; bazı bölgelerin alkolün oluşturduğu hasara daha duyarlı olmasından kaynaklanabileceği gibi alkolün bazı beyin bölgelerinde çok daha fazla değişikliklere neden olmasından da ileri gelmektedir (85).
Araştırma sonuçları bir bütün olarak incelendiğinde; T- labirent testi verilerine göre bazal süre, sakınma 1, sakıma 2 sürelerinin uzaması; şartsız korku süresinin kısalması alkolün, öğrenme ve kısa süreli bellek üzerinde hasarlara neden olduğunun bir göstegesidir. Bu
sonuçlar antioksidan enzim sonuçları ile birleştirildiğinde, alkolün oluşturduğu hasar aşırı Ca++ girişiyle hücre ölümlerine neden olması, hiperpolarizasyonu arttırması, gibi etkilerinin yanı sıra beyin dokularında meydana getirdiği oksidatif hasarla ilişkilidir. T-labirent ve antioksidan sistemlerin karşılaştırıldığı deney sonuçlarına göre alkolün oluşturduğu hasarlara karşı propolis; zincir kırıcı, süpürücü ve bastırıcı etki yapmaktadır.