5. BULGULAR
5.8. Endotelyal Nitrik Oksit Sentaz (eNOS) İmmünreaktivitesi
Endotelyal nitrik oksit sentaz (eNOS) immünreaktivitesini belirlemek için yapılan immünohistokimyasal boyamada eNOS immünreaktivitesi testis dokusunda interstisyel alanda görüldü. eNOS immünreaktivitesi kontrol grubunda (Şekil 31) ve tütün dumanı + HES (Şekil 34) grubunda benzerdi. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında tütün dumanı grubunda (Şekil 32) eNOS immünreaktivitesi açısından anlamlı bir artış vardı (p<0.05). Tütün dumanı grubu ile tütün dumanı + mısırözü yağı grupları (Şekil 33) arasında ise istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmadı (Tablo 15). Negatif kontrolde eNOS immünreaktivitesine rastlanmadı (Şekil 35).
Tablo 15: eNOS immünreaktivitesi.
Değerler ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir.
aKontrol grubuna göre karşılaştırıldığında,
bTütün dumanı grubuna göre karşılaştırıldığında, (p<0.05).
GRUPLAR HİSTOSKOR (yaygınlık x şiddet)
Kontrol grubu 0.28± 0.07
Tütün dumanı grubu 1.60±0.31a
Tütün dumanı + Mısırözü yağı grubu 1.45± 0.35a
Tütün dumanı + HES grubu 0.28± 0.18 b
Şekil 31: Kontrol grubu. İnterstisyel alanda hafif derecede eNOS immünreaktivitesi (→). x400.
Şekil 32: Tütün dumanı grubu. İnterstisyel alanda artmış eNOS immünreaktivitesi (→). x400.
Şekil 33: Tütün dumanı + mısırözü yağı grubu. İnterstisyel alanda artmış eNOS immünreaktivitesi (→). x400.
Şekil 34: Tütün dumanı + HES grubu. İnterstisyel alanda hafif derecede eNOS immünreaktivitesi (→). x400.
Şekil 35: Negatif kontrol. x100.
5.9. Biyokimyasal Analizler
Yapılan analizlerin değerlendirmesinde lipid peroksidasyonunun göstergesi olan MDA düzeylerinin tütün dumanı ve tütün dumanı + mısırözü yağı gruplarında kontrol grubu ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı düzeyde arttığı tespit edildi (p<0.001). Tütün dumanı + HES grubunda ise tütün dumanı ve tütün dumanı + mısırözü yağı gruplarına göre anlamlı düzeyde azalarak kontrol grubuna yakın düzeylerde olduğu saptandı (p<0.001).
Antioksidan savunma sisteminin enzimlerinden olan CAT ve GSH-Px enzim aktivitelerinin; kontrol grubuna göre tütün dumanı ve tütün dumanı + mısırözü yağı gruplarında istatistiksel olarak anlamlı düzeyde azaldığı belirlendi (p<0.001). CAT aktivitesi açısından tütün dumanı + HES ile tütün dumanı ve tütün dumanı + mısırözü yağı grupları arasında istatistiksel açıdan önemli bir fark tespit edilmedi (p>0.05). GSH-Px aktivitesinin tütün dumanı + HES grubunda
tütün dumanı ve tütün dumanı + mısırözü yağı gruplarına göre istatistiksel olarak önemli düzeyde arttığı tespit edildi (p<0.001). Kontrol grubu ile tütün dumanı + HES grubu arasında GSH-Px aktiviteleri açısından istatistiksel açıdan anlamlı bir farklılık tespit edilemedi (p>0.05) (Tablo 16).
Tablo 16: Grupların testis dokusu MDA, CAT ve GSH-Px düzeyleri. MDA (nmol/g doku) CAT (k/g protein) GSH-Px (U/g protein) Kontrol grubu 13,930 ± 0,726b 20,298 ± 1,182b 107,433 ± 6,699b Tütün dumanı grubu 21,867 ± 1,282a 13,119 ± 1,856a 71,417 ± 5,701a Tütün dumanı+ mısırözü yağı grubu 21,311 ± 0,878a 12,413 ± 2,559a 64,910 ± 5,603a Tütün dumanı + HES grubu 13,887 ± 0,942b 14,818± 2,068a 118,720 ± 9,693b p değeri p < 0.001 p < 0.001 p< 0.001
Değerler ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir.
a
Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında,
bTütün dumanı grubu ile karşılaştırıldığında (p < 0.001).
6.TARTIŞMA
Dünyada her yıl yaklaşık 6 milyon kişinin ölümüne neden olan tütün kullanımı, önlenebilir ölüm sebepleri içerisinde ilk sıralarda yer almaktadır. Sigara gibi tütün ürünlerinin kullanımında herhangi bir azalma gerçekleşmezse, 2020 yılında dünyada her yıl yaklaşık 10 milyon kişinin buna bağlı hastalıklar nedeniyle öleceği ve bunlardan 7 milyonunun gelişmekte olan ülkelerde meydana geleceği tahmin edilmektedir (22).
Tütün dumanına maruz kalmanın üreme sistemi, kardiyovasküler sistem, alt ve üst solunum sistemleri ile diğer organ sistemlerine olumsuz etkileri olduğu yapılan çalışmalarda ortaya konulmuştur (21).
İnfertilite günümüzde oldukça yaygın bir sağlık problemi olup, bu konu üzerine yapılan bilimsel çalışmalar hızla devam etmektedir.
Tütün ürünlerinin erkek üreme sistemleri üzerine etkilerini incelemek
amacıyla Wistar cinsi ratlar üzerine yapılan bir çalışmada tütün dumanına maruz kalmanın sperm miktarını, motilitesini ve fertilizasyon kapasitesini düşürdüğü bildirilmiştir (102).
Başka bir çalışmada ise yine Wistar cinsi ratlar, 9 hafta boyunca günde 20 adet sigaranın dumanına maruz bırakılmıştır. Çalışma sonunda sigara dumanına maruz kalan grupta vücut ağırlığının düştüğü, sperm konsantrasyonu, motilitesi ve hareketliliğinin ise bozulduğu rapor edilmiştir (103). La Maestra ve arkadaşları ise erkek farelerde 10 haftalık sigara dumanı maruziyetinin epididimal spermatozoon sayısında azalma ve anormal sperm yüzdesinde artışa neden olduğunu tespit etmişlerdir (104).
Bizim çalışmamızda da yalnızca tütün dumanına maruz kalan gruptaki ratların ortalama vücut ağırlık değişim yüzdesinde, kontrol grubuna kıyasla anlamlı bir azalma gözlendi. Sperm yoğunluğu ve sperm motilitesi açısından gruplar arasında istatistiksel açıdan anlamlı bir fark bulunmadı (p>0,05) Ancak tütün dumanı uygulamasının kontrol grubu ile karşılaştırıldığında anormal sperm oranını önemli bir biçimde arttırdığı tespit edildi.
Spraque-Dawley cinsi ratların 13 hafta boyunca günde 3 defa 8’er dakika sigara dumanına maruz bırakılması ile oluşan testiküler hasarın histolojik değerlendirmesinde ise spermatogenetik seri hücrelerinin sayısında, seminifer tübül epitelinin yüksekliğinde ve tübül çaplarında azalma görülmüştür (105). 2 ay boyunca günde 2 saat sigara dumanına maruz bırakılan Wistar cinsi ratların testis dokularında seminifer tübül germinal epitelinin bütünlüğünde bozulma, spermatogenetik seri hücrelerde yoğun dejenerasyon ve bazı tübüllerin bazal membranlarında ayrılmalar gözlendiği bildirilmiştir (106).
Çalışmamızda da 12 hafta boyunca günde 2 saat tütün dumanına maruz bırakılan ratların testis dokusunda literatür ile uyumlu şekilde seminifer tübül germinal epitelinde dejenerasyon, atrofik tübüller, çok sayıda seminifer tübülün bazal membranlarında ayrılmalar ve interstisyel alanda ödem tespit edildi.
Testis dokusundaki spermatogenetik seri hücrelerinin dejenerasyonu hem gelişimde hem de ilerleyen safhalarda oldukça sık karşılaşılan bir durumdur. Bu dejenerasyonun temelinde esas olarak apoptozis adı verilen programlanmış hücre ölüm mekanizması vardır. Normal spermatogenez sürecinde, hücresel gelişim ve farklılaşmanın yanı sıra gerçekleşen apoptozis sperm oluşumunda da kritik rol oynar (107). Apoptozis ile gerçekleşen hücre eliminasyonu, olgunlaşmakta olan
spermatogenetik seri hücreleri ile Sertoli hücreleri arasında uygun sayısal oranı sağlamaya yönelik fizyolojik bir yanıt olarak tanımlanmıştır (108-110).
Spermatogenezde testiküler germ hücre ölümünün hormonal bir kontrol mekaznizması altında gerçekleştiği bildirilmiştir (111, 112). Seminifer tübül epitelinin ısı, radyasyon veya soğutma gibi çevresel uyaranlara karşı olan hassaslığı da germ hücrelerinin apoptozisini arttıran önemli bir faktördür (113). Sonuç olarak testiküler fizyolojiyi bozan çevresel uyaranların varlığında patolojik düzeyde apoptozis gerçekleşir ve bu durum spermatogenezde bozulmalara dolayısıyla da infertiliteye neden olabilir (114).
Testis dokusu üzerine yapılan bir çalışmada Spraque-Dawley cinsi ratların sigara dumanına maruz kalması sonucunda yoğun apoptozis gözlendiği bildirilmiştir (115). Wistar cinsi ratlar ile yapılan başka bir çalışmada ise 8 hafta boyunca sigara dumanına maruz kalmanın testis dokusunda seminifer tübül dejenerasyonuna, atrofik tübüller sayısında ve apoptozis düzeyinde artışa sebep olduğu gösterilmiştir (116). Bizim çalışmamızda ise 12 haftalık deney süresince günde 2 saat uygulanan tütün dumanının ratların testis dokusunda, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında apoptozisi istatistiksel olarak önemli biçimde arttırdığı tespit edildi.
Nitrik oksit, erkek üreme sistemi üzerinde önemli görevler üstlenerek
sperm motilitesini ve fertilizasyon potansiyelini destekler. Oksidatif stres gibi
riskli durumlarda artan NO konsantrasyonu, testis dokusu üzerinde olumsuz etki
gösterir. Testis torsiyonunda ve deneysel inflamasyon çalışmalarında NO konsantrasyonunun belirgin biçimde arttığı bildirilmiştir (117). Spermatogenetik seri hücrelerindeki apoptozis artışı ile NOS aktivitesinin artışı arasında ilişki
olduğu rapor edilmiştir (118). Yapılan bir çalışmada Wistar cinsi ratların testis dokusunda kadmiyum ile oluşturulmuş hasar sonucu eNOS immünreaktivitesinin arttığı bildirilmiştir (119). Bizim çalışmamızda da 12 hafta boyunca tütün dumanına maruz kalan ratlarda interstisyel alanda eNOS immünreaktivitesinin kontrol grubuna kıyasla anlamlı derecede arttığı görüldü.
Hesperetin ile yapılan ilk çalışmalar daha çok anti-oksidan, anti- inflamatuvar, anti-karsinojenik gibi özellikleri üzerine olmuştur (80). Yeni farmakolojik özellikleri, moleküler hedefleri ve etki mekanizmaları keşfedildikçe hesperetin ile ilgili çalışmalar artmıştır (120). Flavonoidler gibi antioksidan bileşikler özellikle oksidatif hasar kaynaklı çeşitli kanser türleri ve kardiyovasküler hastalıklar gibi patolojik durumlardan korunma açısından oldukça önemli roller üstlenmişlerdir (80, 121).
Tütün dumanın testis dokusunda meydana getireceği hasarlara karşı hesperetinin nasıl bir etki göstereceği ile ilgili herhangi bir literatür çalışması bulunmamaktadır. Ancak hesperetinin H2O2, nikotin, gama radyasyon,
peroksinitrit, ve siklofosfamid ile oluşturulmuş çeşitli doku hasarlarına karşı koruma gösterdiği ve oluşan bu hasarları azalttığı gösterilmiştir (85, 122-125). Yapılan bir çalışmada rat testis dokusunda doksorubisin ile oluşturulmuş oksidatif stres kaynaklı meydana gelen testiküler hasara karşı 25 mg/kg, 50 mg/kg ve 100 mg/kg dozlarında hesperetin uygulanmasının koruma sağladığı rapor edilmiştir (126). Diğer bir çalışmada ise teratojen, karsinojen, ve mutajen özellik gösteren bir hidrokarbon olan benzopiren ile oluşturulan testiküler hasar üzerine
uygulanan hesperetinin sperm morfolojisi, motilitesi ve sayısında düzelme yaptığı tespit edilmiştir (127).
Shagirtha ve ark. tarafından yapılan bir çalışmada kadmiyum ile oluşturulan testiküler hasara karşı koruyucu amaçla kullanılan hesperetinin 40 mg/kg dozunda maksimum koruma elde edildiği bildirilmiştir. Bu dozda uygulanan hesperetinin testis dokusunda oluşan histopatolojik değişikliklere belirgin bir şekilde azalttığı, oksidatif stres belirteci olan MDA seviyesini düşürdüğü ayrıca antioksidan enzim sistemlerinin önemli üyelerinden CAT ve GSH-Px seviyelerini de arttırdığı rapor edilmiştir (128). Deneysel olarak oluşturulan testis torsiyonu çalışmasında ise hesperetinin testis dokusunda MDA seviyesini azaltığı, CAT aktivitesini ise arttırdığı rapor edilmiştir (129)
Bizim çalışmamızda da, tütün dumanına maruz bırakılan gruptaki ratların testis dokusunda; seminifer tübül germinal epitelinde dejenerasyon, vasküler konjesyon, çok sayıda seminifer tübül bazal membranlarında ayrılmalar ve interstisyel alanda ödem tespit edildi. Tütün dumanı ile birlikte HES uygulanan gruptaki ratların testis dokusunda ise literatür ile uyumlu olarak kontrol grubuna yakın görünümlü seminifer tübül germinal epiteli ve normal spermatogenez izlendi. Seminifer tübül bazal membran ayrılmalarında azalma, germinal epitel dejenerasyonunda, vasküler konjesyonda ve interstisyel ödemde belirgin şekilde iyileşmeler gözlendi.
Ratlarla yapılan bir çalışmada doksorubisin ile oluşturulmuş oksidatif strese karşı uygulanan hesperetinin kalp dokusunda apotozisi azattığı rapor edilmiştir (130).
Bizim çalışmamızda da tütün dumanına maruziyetine bağlı oluşan oksidatik stres kaynaklı hasara karşı 50 mg/kg dozunda uygulanan hesperetinin testis dokunda apoptotik indeksi azalttığı gözlendi. Ayrıca biyokimyasal analizlerde ise hesperetinin MDA seviyesini azalttığı, GSH-Px aktivitesini ise arttırdığı tespit edildi. Bununla birlikte hespertinin CAT seviyesinde anlamlı bir değişim yapmadığı gözlendi.
Elde ettiğimiz bulgular ışığında 12 hafta boyunca günde 2 saat uygulanan tütün dumanının rat testis dokusunda hasara yol açtığı tespit edildi. Antioksidatif özelliği bilinen ve özellikle turunçgillerin yapısında bulunan hesperetinin, tütün dumanı maruziyetinin testislerde meydana getirdiği hasara karşı koruyucu bir etkisinin olduğu gözlendi.
7. KAYNAKLAR
1. Putz R, Pabst R. Sobotta İnsan Anatomisi Atlası. 5. Baskı, İstanbul: Beta basım yayım dağıtım, 2001; 190.
2. Arıncı K, Elhan A. Anatomi. 3. Baskı, Ankara: Güneş Kitabevi, 2001; 330-332.
3. Sadler TW. Langman’s Medikal Embriyoloji. Basaklar C (Çeviren). 6. baskı, Ankara: Palme Yayıncılık, 1990; 257.
4. Moore KL. Persaud TVN. Klinik Yönleri ile İnsan Embriyolojisi. Yıldırım M, Dalcık H (Çevirenler). 2. Baskı, İstanbul: Nobel Tıp Kitapevleri, 2009; 263-265.
5. Hall JE. Guyton ve Hall Tıbbi Fizyoloji. Yegen B (Çeviren). 12. Baskı, İstanbul: Nobel Tıp Kitabevleri, 2013; 973-984.
6. Junqueira LC, Carneıro J. Temel Histoloji. Solakoğlu S, Aytekin Y (Çevirenler). İstanbul: Nobel Tıp Kitapevleri, 2009; 418-427.
7. Ross MH, Pawlina W. Histology A Text and Atlas. 6th Edition, Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 2011; 791.
8. Ovalle WK, Nahirney PC. Netter Temel Histoloji. Müftüoğlu S, Kaymaz F, Atilla P (Çevirenler). Ankara: Güneş Tıp Kitabevleri, 2009; 385.
9. Eroschenco VP. Di Fiore. Histoloji Atlası Fonksiyonel İlişkileriyle, Demir R. (Çeviren). Ankara: Palme Yayıncılık, Ankara. 2013; 479.
10. Türkiye’de Tütün. Yapı ve Kredi Bankası A.Ş. İktisadi Araştırma Yayınları, 1971; 8. 11. Gür M. Tütüncülüğe Giriş ders Notları, 1977;1.
12. Otan H, Apti R. Tütünün Sistematikteki Yeri ve Özellikleri. T.C. Tarım Orman ve Köy İşleri Bakanlığı. İzmir, 1989; 83: 10.
13. Aslan ME. 2000’li yıllarda Türkiye’de uygulanan tütün politikalarında değişim ve makro etkileri. Dönem projesi. Ankara Üniversitesi, 2009.
14. Otan H, Apti R. Tütün. 1.baskı. İzmir: ETAEM yayını, 1989: 9.
15. Aksu S. Tütün kimya ve teknolojisi. 1. baskı. İstanbul: Tekel Enstitüleri yayınları 1967. 16. Tütün Eksperleri Yüksek Okulu. Tütüncülüğe giriş. İstanbul: TEYO yayını, 1978. 17. Nafiz Z. Tütün ziraati ve hastalıkları. 1. baskı, İstanbul: Cezri matbaa, 1932.
18. Picciotto MR. Nicotine as a modulator of behavior: beyond the inverted U. Trends Pharmacol Sci 2003; 24: 493-499.
19. Wonnacott S, Sidhpura N, Balfour DJ. Nicotine: from molecular mechanisms to behaviour. Curr Opin Pharmacol 2005; 5: 53-59.
20. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans, Tobacco Smoke and Involuntary Smoking. World Health Organization International Agency for Research on Cancer, 2004; 83.
21. Tütün ve tütün kontrolü. Toraks kitapları. Türk Toraks Derneği. İstanbul: Aves Yayıncılık, Ocak 2010.
22. Türkiye Halk Sağlığı Kurumu. Küresel Yetişkin Tütün Araştırması Türkiye 2012. Ankara: Anıl Matbaa, 2014.
23. Hecht SS. Cigarette smoking: cancer risks, carcinogens, and mechanisms. Langenbecks Arch Surg 2006; 391: 603-613.
24. Doll R, Peto R, Hall E, et al. Mortality in relation to consumption of alcohol: 13 years' observations on male British doctors. BMJ 1994; 309: 911-918.
25. Nusbaum ML, Gordon M, Nusbaum D, et al. Smoke alarm: A review of the clinical impact of smoking on women. Prim Care Update Ob/Gyns 2000; 7: 207-214.
26. US Public Health Service, US Department of Health and Human Services, The Office of Disease Prevention and Health Promotion. The Facts Palo Alto, CA: Bull Publishing Co.1988.
27. Ezzati M, Lopez AD. Estimates of global mortality attributable to smoking in 2000. Lancet 2003; 362: 847-852.
28. Kohen R, Nyska A. Oxidation of biological systems: oxidative stress phenomena, antioxidants, redox reactions, and methods for their quantification. Toxicol Pathol 2002; 30: 620-650.
29. Free radical biology and medicine: it's a gas, man. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2006; 29: R491-511.
30. Domej D. Oxidative stress and free radicals in COPD – implications and relevance for treatment. International Journal of COPD 2014; 9: 1207–1224.
31. Aprioku JS. Pharmacology of Free Radicals and the Impact of Reactive Oxygen Species on the Testis. J Reprod Infertil 2013; 14: 158-172.
32. Aitken RJ. Molecular mechanisms regulating human sperm function. Mol Hum Reprod 1997; 3: 169-173.
33. Gil-Guzman E, Ollero M, Lopez MC, et al. Differential production of reactive oxygen species by subsets of human spermatozoa at different stages of maturation. Hum Reprod 200; 16: 1922-1930.
34. Agarwal A, Prabakaran SA, Said TM. Prevention of oxidative stress injury to sperm. J Androl 2005; 26: 654-660.
35. Turner TT, Lysiak JJ. Oxidative stress: a common factor in testicular dysfunction. J Androl 2008; 29: 488-498.
36. Sikka SC. Relative impact of oxidative stress on male reproductive function. Curr Med Chem 2001; 8: 851-862.
37. Agarwal A, Saleh RA. Role of oxidants in male infertility: rationale, significance, and treatment. Urol Clin North Am 2002; 29: 817-827.
38. Agarwal A, Sharma RK, Nallella KP, et al. Reactive oxygen species as an independent marker of male factor infertility. Fertil Steril 2006; 86: 878-885.
39. Alvarez JG, Touchstone JC, Blasco L, Storey BT. Spontaneous lipid peroxidation and production of hydrogen peroxide and superoxide in human spermatozoa. Superoxide
dismutase as major enzyme protectant against oxygen toxicity. J Androl 1987; 8: 338- 348.
40. Morte MI, Rodrigues AM, Soares D, et al. The quantification of lipid and protein oxidation in stallion spermatozoa and seminal plasma: seasonal distinctions and correlations with DNA strand breaks, classical seminal parameters and stallion fertility. Anim Reprod Sci 2008; 106: 36-47.
41. Yeni D, Gundogan M, Cigerci IH, et al. Seasonal variation of oxidative stress parameters in ram seminal plasma. J Anim Vet Adv 2010; 9: 49-55.
42. Förstermann U, Schmidt HH, Pollock JS, et al. Isoforms of nitric oxide synthase: characterization and purification from different cell types. Biochem Pharmacol 1991; 42: 1849–1857.
43. Nathan C, Xie QW. Nitric oxide synthases: roles, tolls, and controls. Cell 1994; 78: 915–918.
44. Schmidt HH, Walter U. NO at work. Cell 1994; 8: 919–925.
45. Kleinert H, Pautz A, Linker K, Schwarz PM. Regulation of the expression of inducible nitric oxide synthase. Eur J Pharmacol 2004; 500: 255–266.
46. Zini A, O’Bryan MK, Magid MS, Schlegel PN. Immunohistochemical localization of endothelial nitric oxide synthase in human testis, epididymis, and vas deferens suggests a possible role for nitric oxide in spermatogenesis, sperm maturation, and programmed cell death. Biol Reprod 1996; 55: 935–941.
47. Kang Y–M, Zhang J, Li J, Duan X–L. Expression of eNOS in rat testis from infancy to maturity. Acta Zool Sin 2003; 49: 339–345.
48. Lee NPY, Cheng CY. Nitric oxide/nitric oxide synthase, spermatogenesis, and tight junction dynamics. Biol Reprod 2004; 70: 267–276.
49. Sun L, Ren YP, Jiang W, et al. Expression and role of nitric oxide synthase in the testis and epididymis of Macaca fascicularis. Zhonghua Nan Ke Xue 2006; 12: 876–878. 50. Lee NPY, Chang CY. Nitric oxide and cyclic nucleotides. Their roles in junction
dynamics and spermatogenesis. Oxid Med Cell Longev 2008; 1: 25–32.
51. O’Bryan MK, Zini A, Cheng CY, Schlegel PN. Human sperm endothelial nitric oxide synthase expression: correlation with sperm motility. Fertil Steril 1998; 70: 1143–1147. 52. Davidoff MS, Middendorff R, Mayer B, Holstein AF. Nitric oxide synthase (NOS–I) in
Leydig cells of the human testis. Arch Histol Cytol 1995; 58: 17–30.
53. Del Punta K, Charreau EH, Pignataro OP. Nitric oxide inhibits Leydig cell steroidogenesis. Endocrinol 1996; 137: 5337–5343.
54. Kostic TS, Andric SA, Maric D, et al. Involvement of inducible nitric oxide synthase in stress–impaired testicular steroidogenesis. J Endocrinol 1999; 163: 409–416.
55. Kim BH, Kim CH, Jung KY, et al. Involvement of nitric oxide during in vitro fertilization and early embryonic development in mice. Arch Pharm Res 2004; 27: 86–93.
56. Welch C, Watson ME, Poth M, et al. Evidence to suggest nitric oxide is an interstitial regulator of Leydig cell steroidogenesis.. Metabolism 1995; 44, 234–238.
57. Sengoku K, Tamate K, Zoshida T, et al. Effects of low concentrations of nitric oxide on the zona pellucida binding ability of human spermatozoa. Fert. Steril 1998; 69, 522–527. 58. Gluecksmann A. Cell death in normal vertebrate ontogeny. Biological Reviews 1951; 26:
59-86.
59. Lockshin RA and Zakeri Z. Programmed cell death and apoptosis: origins of the theory. Nat Rev Mol Cell Biol 2001; 2: 545-550.
60. Leist M, and Jaattela M. Four deaths and a funeral: from caspases to alternative mechanisms. Nat. Rev. Mol. Cell Biol 2001; 2: 589-598.
61. Daston GP, Gooch JW, Breslin WJ, et al. Environmental estrogens and reproductive health: a discussion of the human and environmental data. Reprod Toxicol 1997; 11: 465–481.
62. Jensen TK, Toppari J, Keiding N, Skakkebaek NE. Do environmental estrogens contribute to the decline in male reproductive health? Clin Chem 1995; 41: 1896–1901. 63. Cravedi JP, Zalko D, Savouret JF et al. The concept of endocrine disruption and human
health. Med Sci 2007; 23: 198–204.
64. Erkkila K, Pentikainen V, Wikstrom M, Parvinen M, Dunkel L. Partial oxygen pressure and mitochondrial permeability transition affect germ cell apoptosis in the human testis. J Clin Endocrinol Metab 1999; 84: 4253–4259.
65. Tripathi R, Mishra DP, Shaha C. Male germ cell development: turning on the apoptotic pathways. J Reprod Immunol 2009; 83: 31–35.
66. Moreno RD, Lizama C, Urzua N, Vergara SP, Reyes JG. Caspase activation throughout the first wave of spermatogenesis in the rat. Cell Tissue Res 2006; 325: 533–540.
67. Shaha C, Tripathi R, Mishra DP. Male germ cell apoptosis: regulation and biology. Phil. Trans. R. Soc. B 2010; 365: 1501–1515.
68. German J. Food processing and lipid oxidation. Adv Exp Med Biol 1999; 459: 23–50. 69. Gutteridge JMC, Halliwell B. Antioxidants in Nutrition, Health and Disease Oxford;
Oxford University Press, 1994.
70. Jacob, R.A., The Integrated Antioxidant System. Nutr Res 1995; 15: 755-766.
71. Hurrell R Influence of vegetable protein sources on trace element and mineral bioavailability. J. Nutr 2003; 133: 2973S–2977S.
72. Liu RH. Potential synergy of phytochemicals in cancer prevent: mechanims of action, J. Nutr 2004; 134: 3479-3485.
73. Harborne JB, Williams CA. Advances in flavonoid research since 1992. Phytochemistry 2000; 55: 481–504.
74. Pietta PG. Flavonoids as antioxidants. J Nat Prod 2000; 63: 1035–1042.
75. Erlund I. Review of the flavonoids quercetin, hesperetin, and naringenin. Dietary sources, bioactivities, bioavailability, and epidemiology. Nutrition Research 2004; 24: 851–874.
76. Arul D, Subramanian P. Inhibitory effect of naringenin (citrus flavonone) on N- nitrosodiethylamine induced hepatocarcinogenesis in rats, Biochemical and Biophysical Research Communications 2013; 434: 203–209.
77. Keser S, Celik S, Turkoglu S, et al. Total phenolic contents and free-radical scavenging activities of grape (Vitis vinifera L.) and grape products, International Journal of Food Sciences and Nutrition 2013; 64: 210–216.
78. Kinoshita T, Lepp Z, Kawai Y, et al. An integrated database of flavonoids. BioFactors 2006; 26: 179–188.
79. Mouly P, Gaydou EM, Auffray A. Simultaneous separation of flavanone glycosides and polymethoxylated flavones in citrus juices using lipid chromatography. J Chromatogr A 1998; 800: 171–179.
80. Garg A, Garg S, Zaneveld LJ, Singla AK. Chemistry and pharmacology of the citrus bioflavonoid hesperidin. Phytother Res 2001; 15: 655–669.
81. Constantin RP, do Nascimento GS, Constantin RP, et al. Citrus Flavanones Affect Hepatic Fatty Acid Oxidation in Rats by Acting as Prooxidant Agents. Biomed Res Int. 2013; http://dx.doi.org/10.1155/2013/342973.
82. Cai YZ, Luo Q, Sun M, Corke H. Antioxidant activity and phenolic compounds of 112 traditional Chinese medicinal plants associated with anticancer. Life Sci 2004; 74: 2157–2184.
83. Lin N, Sato T, Takayama, et al. Novel anti-inflammatory actions of nobiletin, a citrus polymethoxy flavonid, on human synovial fibroblasts and mouse macrophages. Biochem Pharmacol 2003; 65: 2065–2071.
84. Kaur G, Tirkey N, Chopra K. Beneficial effect of hesperidin on lipopolysaccharide- induced hepatotoxicity. Tox-icology 2006; 226: 152–160.
85. Kalpana KB, Srinivasan M, Menon VP. Evaluation of antioxidant activity of hesperidin