Elektroforez uygulamaları

PCR sonucu oluşan amplifikasyon ürünlerine ait DNA bant görüntülerinin elde edilebilmesinde takip edilen aşamalar aşağıda detaylı bir şekilde verilmiştir.

3.2.2.10.1. Tris-borik asit-EDTA (TBE) elektrolit çözeltisi

Bu çalışmada tampon çözelti olarak Tris-Borik asit-EDTA (TBE) çözeltisi kullanılmıştır. Çözeltide kullanılan EDTA (Etilen Diamin Tetra Asetik Asit) 0,5 Molar (M) ve pH 8.0 olacak şekilde hazırlanmıştır. Daha sonra 10X yoğunlukta çözelti hazırlanmaya başlanmıştır. Borik asit geç çözünen bir maddedir, bu nedenle manyetik karıştırıcı cihazı yardımıyla önce bir miktar saf suda borik asit çözünmüş, ardından Tris, son olarak ise EDTA ilave edilmiştir. Böylece tortu oluşması engellenmiştir. Kimyasallar tamamen çözündükten sonra çözeltinin son hacmi 1

litreye tamamlanmıştır. Bu stok çözeltiden 100 ml alınıp üzeri saf su ile 1 litreye tamamlanarak 1X yoğunlukta TBE elde edilmiştir. Bu çözelti hem elektroforez tankına konulmuş hem de agarozu eritmek için jel hazırlamada kullanılmıştır. Çizelge 3.6’da bu çözeltinin hazırlanmasında kullanılan kimyasallar ve miktarları verilmiştir.

Çizelge 3.6 10X TBE (1litre) stok çözeltisinin hazırlanmasında kullanılan kimyasal maddeler ve miktarları

10X stok TBE tampon çözeltisi (1litre) Miktar

Tris 108 g

Borik asit 55 g

EDTA (0.5 M, pH8.0) 40 ml

3.2.2.10.2. % 2’lik agaroz jelin hazırlanması ve jel tepsisine dökülmesi

PCR’da elde edilen DNA parçalarını elektroforezde birbirinden ayırmak için agaroz jel kullanılmıştır. Jel hazırlarken, 1X yoğunluktaki TBE tampon çözeltiden 200 ml ölçülerek bir erlenmayere boşaltılmış ve üzerine 4 g agaroz (Serva Inc.) ilave edilmiştir. Bu karışım daha sonra yüksek sıcaklıkta (350–500 o_{C) çalışan bir}

mikrodalga fırın içinde 3-5 dk kaynatılarak eritilmiştir. Kaynama esnasında homojen bir karışım olması amacıyla zaman zaman erlenmayer hafifçe sallamak suretiyle karıştırılmıştır. Şeffaf bir görünüm kazanan jel mikrodalga fırından çıkarılarak soğumaya bırakılmıştır.

Jel soğurken jelin döküleceği tepsinin kenarlarına jelin dışarı taşmasını önleyen lastikler takılmış, DNA örneklerinin yükleneceği yuvaların oluşması için çok dişli (40 dişli) iki tarak yerleştirilmiştir (EK-C.1). Daha sonra soğumakta olan jelin içine PCR sonucu oluşan bantların görüntüleme cihazında ultra viyole (UV) ışığında görüntülenebilmeleri için 3.5 µl etidyum bromür (DNA’nın parlak, flüoresan bir

görünüm kazanmasını sağlar) ilave edilmiştir. Sürekli sallamak suretiyle soğutulan jel, jel kalıbında ve tarakların bulunduğu bölgelerde hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edilerek tepsiye dökülmüş ve katılaşıncaya kadar soğumaya bırakılmıştır. Jel donduktan sonra taraklar ve lastikler jele zarar vermeden dikkatli bir şekilde çıkarılmış ve jel, jel tepsisi ile birlikte elektroforez tankının içine yerleştirilmiştir. Daha sonra hazırlanan 1X TBE elektrolit çözeltisinden jelin üst kısmını kapatacak kadar elektroforez tankına dökülmüştür.

3.2.2.10.3. PCR ürünlerinin agaroz jele yüklenmesi

PCR’da çoğaltılan DNA parçalarının elektroforez içindeki 1X TBE çözeltisine karışmasını önlemek ve yürütülmesi esnasında kolay takibi amacıyla yoğunluğu yüksek 6X yükleme boyası (loading dye) adı verilen bir çözelti hazırlanmıştır (EK-C.3). Yükleme boyası hazırlamada kullanılan kimyasallar ve oranları Çizelge 3.7’de verilmiştir.

Çizelge 3.7 6X yükleme boyası hazırlamada kullanılan kimyasallar ve oranları

6X Yükleme Boyası (loading dye) Çözeltisi

10 mM Tris-HCl (pH 7.6) % 0.03 bromophenolblue % 0.03 xylene cyanol FF

%60 gliserol 60 mM EDTA

Agaroz jele yüklenecek 25 µl hacmindeki her bir PCR tüpüne hazırlanan yükleme boyası çözeltisinden 4 µl ilave edilmiş ve homojen bir şekilde karıştırılmıştır. Daha sonra, otomatik pipetman yardımıyla her tüpten 16 µl karışım

alınarak jelde hazır bulunan yuvalara sırayla yüklenmiştir (EK-C.2). Yükleme yaparken PCR ürünlerinin birbirine karışmamasına ve dağılmamalarına dikkat edilmiştir.

Çoğaltılan DNA parçalarının boyunu tespit etmek amacıyla örneklerin başındaki ve sonundaki yuvalara uzunluk markörü olarak EcoRI ve HindIII restriksiyon enzimleriyle kesilmiş, Lambda (λ) DNA’dan (Fermentas) 0.5 µg yüklenmiştir (Şekil 3.3).

Şekil 3.3 EcoRI ve HindIII restriksiyon enzimleriyle kesilmiş λ DNA, molekül ağırlığı ve yüzdesi (Anonymous, 2007b)

3.2.2.10.4. PCR ürünlerinin agaroz jelde yürütülmesi

Bir tarafına negatif (-), diğer tarafına pozitif (+) yük verilen elektroforez tankının (-) yüklü tarafına yüklenen DNA örnekleri, aynı yüklerin birbirini itmesi ve zıt yüklerin birbirini çekmesi prensibine göre, agaroz jelin konsantrasyonuna bağlı olarak oluşan porlardan zıt yüklü tarafa doğru DNA parçasının uzunluğu ile orantılı

bir şekilde hareket eder (küçük DNA parçaları, daha küçük por çapına sahip olan matriks şeklindeki jelde daha hızlı hareket ettikleri için büyük parçalardan daha çabuk yol alırlar). Parçaların boyları, örneklerle birlikte yürütülen uzunluğu belli standard markörler sayesinde net bir şekilde belirlenebilir (Özbek 2006).

Bu çalışmada agaroz jele yüklenen PCR ürünlerine yatay elektroforez cihazına (Thermo) bağlı güç kaynağı (Thermo EC250-90) ile 60 voltta 3-4 saat elektrik akımı verilmiştir (EK-D.2). Belirli aralıklarla (20-30 dk) görüntüleme cihazında UV ışığı altında jelden görüntü alınmış ve elektronik ortamda saklanmıştır.

3.2.2.10.5. Agaroz jelin görüntülenmesi ve RAPD bantlarının elde edilmesi

Elektroforetik olarak boylarına göre (boyları ile ters orantılı olarak) ayrıştırılan PCR ürünlerinin bulunduğu jel çözelti içerisinden alınarak görüntüleme cihazına (Vilber Lourmat) yerleştirilmiştir (EK-D.3). RAPD bantları UV ışığı altında görüntülenmiş, görüntüler jel dokümantasyon sistemindeki özel bir program içinde TIFF dosyası olarak saklanmıştır.

3.2.2.10.6. İstatistiki analizlerde kullanılacak verilerin elde edilmesi

İstatistiki analizlerde kullanılacak veriler RAPD bantlarının değerlendirilmesi ile elde edilmiştir. Bu teknik kullanılarak yaptığımız tekrarlı uygulamalarda elde edilen PCR ürünleri görüntüleme cihazında görüntülendiğinde, jelde parlak görünümlü bantların olduğu görülmüştür. Üzerinde çalışılan her bireyde benzerlik ya da farklılıkları belirlemek amacıyla, aynı satırdaki bu bantlara bakılarak elde edilen sonuçlar var (1) ya da yok (0) şeklinde skorlanarak kaydedilmiştir. Kaydedilen bu rakamlar sonucu elimizde Çizelge 3.8’ deki gibi bir veri (X) matrisi oluşturulmuştur.

X matrisinde, “Ç” üzerinde araştırma yaptığımız bireyleri (Ç=1,...,m), “M” ise elde ettiğimiz markörleri (bantları) (M=1,...,n) ifade etmektedir.

Çizelge 3.8 Veri matrisi

Ç1 Ç2 Ç3 Ç... Çm M1 1 0 0 ... 1 M2 1 1 0 ... 1 M3 0 0 1 ... 0 M... ... ... ... ... ... Mn 0 1 0 ... 1