EKLER

Ao contrário das amplificações dirigidas, as abordagens de amplificação não- dirigidas à sequência que se pretende analisar cobrem, de forma mais ampla, a deteção de novos vírus, pelo facto de não exigirem um conhecimento prévio das sequências virais a detetar. Por esta razão, estas estratégias alternativas são frequentemente utilizadas para a descoberta de novos vírus, e suportam parcialmente o desenvolvimento da metagenómica (61,62,65).

Existem inúmeras abordagens baseadas em amplificações não-dirigidas, sendo os métodos de hibridação subtrativa uma delas. Um exemplo deste método é a técnica RDA (do inglês Representational difference analysis), que combina a hibridação subtrativa com a amplificação de um alvo genético limitado por adaptadores sintéticos de sequência conhecida, de forma a detetar diferenças entre duas amostras semelhantes (67). As amostras “tester”, contendo as sequências virais, e as amostras “driver” (desprovida de vírus), são hibridadas em conjunto de modo a reduzir as sequências comuns entre ambas (65). As diferenças entre elas são ampliadas através de amplificações que fazem uso de primers que não são dirigidos às sequências que se pretendem caracterizar, mas sim aos adaptadores sintéticos que a elas foram inicialmente ligados. Esta técnica impõe à partida limitações pelo facto de exigir grandes quantidades de material infetado e não infetado do mesmo indivíduo (68). Adicionalmente, têm ainda a desvantagem de não ter sensibilidade suficiente para detetar vírus quando a carga viral é baixa ou quando a sequência viral não se distingue claramente da amostra controlo (61).

A técnica SISPA (do inglês Sequence-Independent Single Primer Amplification) contorna as limitações da técnica anteriormente mencionada (61), tendo como vantagens a sua simplicidade e velocidade, aliadas ao facto de não introduzir viés na identificação de grupos específicos de vírus (65). Esta técnica foi inicialmente descrita por Reyes em 1991 (69), porém tem vindo a ser desenvolvida e adaptada de modo a permitir a deteção de vírus de genoma de RNA ou DNA com elevada sensibilidade (61).

inclui a combinação dos métodos de filtração, deposição das partículas virais por ultracentrifugação e sua (eventual) purificação através da utilização de gradiente de densidade, e digestão enzimática de ácidos nucleicos não-encapsidados (não-virais) usando DNase e RNAse (65).

No caso dos genomas virais de RNA (a representação esquemática desta técnica pode ser observada na Figura 6), as sequências viras são convertidas em cDNA utilizando primers com uma sequência definida, associada a uma região de sequência aleatória compreendendo de 6-8 posições nucleotídicas totalmente degeneradas no extremo 3’ (ex: 5' GCCGGAGCTCTGCAGATATCNNNNNN 3') ou em que o extremo 3’ traduz uma região com múltiplos (18-20) nucleótidos de desoxitimidina (ex: 5' GCCGGAGCTCTGCAGATATC(T)20 3'), permitindo uma hibridação destes primers a

RNAs caudas de poly-A. A segunda cadeia de DNA é sintetizada mediante a utilização de uma polimerase parcialmente desprovida de atividade exonucleásica na presença dos primers anteriormente mencionados. A dupla cadeia de DNA é posteriormente amplificada por PCR utilizando um primer complementar à região constante definida dos primers utilizados (ex: 5' GCCGGAGCTCTGCAGATATC 3') (70). Frequentemente a SISPA permite identificar genomas virais desconhecidos presentes numa qualquer amostra biológica em quantidades relativamente limitadas (67). No entanto, a sua performance pode ser comprometida na presença de ácidos nucleicos contaminantes (ambientais ou provenientes das células hospedeiras infetadas), dado que todas as moléculas de DNA podem ser simultaneamente amplificadas, podendo assim dificultar a identificação das sequências virais (65). Tal facto deverá ser tido especialmente em conta caso os ácidos nucleicos contaminantes (não-virais) sejam muito abundantes. Existem ainda outras variações e adaptações de SISPA, como é o caso da técnica de VIDISCA (do inglês Virus Discovery cDNA-AFLP) que se baseia nos mesmos princípios de SISPA, mas que combina a utilização de dois pares de primers (em vez de um), a uma nested-PCR, tornando as amplificações pretendidas mais específicas e sensíveis (67). Para além destas, outras técnicas de amplificação não- dirigida como são os casos de rPCR (do inglês random PCR) e RCA (do inglês Rolling Circle Amplification) têm sido amplamente utilizadas na deteção de novos vírus (65). Como principal desvantagem aponta-se o facto de estas abordagens favorecerem as

sequências virais maioritárias presentes numa amostra, o que dificulta a identificação de sequências virais que possam estar presentes em baixa quantidade.

Figura 6 - Representação esquemática da técnica SISPA. As descrições técnicas estão referidas no texto acima [adaptado de (70)].

As dificuldades encontradas, até há cerca de uma década atrás, no que diz respeito à descoberta/caracterização de novos vírus usando umas das diferentes abordagens acima descritas podem, hoje em dia, ser parcialmente obviadas através da combinação das primeiras às tecnologias genericamente conhecidas como NGS (do inglês Next Generation Sequencing). No seu conjunto, estas traduzem metodologias de sequenciação de alto rendimento, que geram milhões de sequências simultaneamente a partir de uma amostra (71). Existem muitas plataformas disponíveis e o seu desenvolvimento combina vários fatores responsáveis pelo sucesso notório destas tecnologias (nomeadamente velocidade, automatização, alto rendimento, e precisão (61)), e que têm permitido determinar facilmente os genomas de novos vírus (31).

A virologia entrou numa era onde é possível, condicionalmente, identificar centenas ou provavelmente milhares de novos vírus (15). Durante os últimos anos, tem- se assistido à emergência da metagenómica como uma nova ferramenta poderosa com extensa aplicação em virologia, devendo-se sobretudo ao advento das NGS (61,71). No

entanto, mesmo quando estas abordagens (metagenómica baseada na utilização de NGS) não podem ser executadas por constrangimentos financeiros, técnicos, logísticos ou computacionais, a identificação de um qualquer vírus numa amostra biológica, sendo ele conhecido ou totalmente novo, pode ser feita explorando algumas das abordagens anteriormente descritas ao longo desta secção. Uma vez que vários estudos sugerem que o domínio da virologia explorou menos de 1% da diversidade viral existente (61), e sendo os vírus as entidades biológicas mais ubíquas e abundantes na Terra (72), existe ainda muito por explorar.