SOBRENADANTE 1 + 2
Centrifugação 10.000 x g, por 30 minutos, 4 C
RESÍDUO SOBRENADANTE Filtração em papel Diálise
EXTRATO TOTAL
(PREP.A)
Re-extração nas mesmas condições
FIGURA 5 – Esquema geral de purificação da soyatoxina (SYTX).
NaCl 0,15 – 0,7 M Cromatografia Sepharose-4B-Tripsina
EXTRATO TOTAL
(PREP.A)
Precipitação com (NH4 )2SO4F
20-55%(PREP.B)
Cromatografia em DEAE-Celulose PREP.C-Ia PREP.C-Ib PREP.C-IIIa PREP.D-II PREP.C-II Cromatografia Superdex 200 HR 10/30PREP.C-IIIb
PREP.D-Ib
SOYATOXINA
(SYTX)
NaCl 0,15 M PREP.D-IaMaterial não retido Material retido
4.4.3 – Cromatografias
4.4.3.1 – Cromatografia de Troca Iônica em Matriz de DEAE-Celulose
Alíquotas do PREP.B (400 mgP) foram aplicadas em coluna de DEAE-celulose, previamente equilibrada com Tris-HCl 0,025 M, pH 7,5. Em seguida, a coluna foi percolada com o mesmo tampão de equilíbrio até que as proteínas não retidas, Preparados C-Ia e C-Ib (PREP.C-Ia e C-Ib) fossem completamente removidas. NaCl 0,15 M foi acrescido ao tampão de equilíbrio para eluição do Preparado C-II (PREP.C-II). Logo após, para a eluição das proteínas ainda retidas na matriz, foi aplicado um gradiente salino (NaCl) na faixa de 0,15 a 0,7 M. A cromatografia foi monitorada através de leituras de absorbância a 280 nm. Ao final do processo, a toxicidade para camundongos foi avaliada pelas vias ip e iv.
4.4.3.2 – Cromatografia de Afinidade em Matriz de Sepharose-4B-Tripsina
A fração eluída da coluna de DEAE-celulose após aplicação do gradiente salino, Preparado C-IIIb (PREP.C-IIIb), encerrando toda atividade tóxica, foi utilizada para dar continuidade ao processo de purificação da toxina. Esse material foi precipitado com sulfato de amônio 0-90%, centrifugado a 10.000 x g, por 30 minutos, e dialisado exaustivamente contra tampão Tris-HCl 0,025 M, pH 7,5. Alíquotas deste material (10 mg) foram aplicadas em coluna de Sepharose-4B-tripsina, previamente equilibrada com tampão Tris-HCl 0,025 M, pH 7,5, contendo NaCl 0,15 M. As proteínas não retidas, Preparados D-Ia e D-Ib (PREP.D-Ia e PREP.D-Ib, respectivamente), foram eluídas com o próprio tampão de equilíbrio. Para eluição do material retido na coluna, Preparado D-II (PREP.D-II), foi aplicado tampão glicina-HCl 0,05 M, pH 2,2. As frações
correspondentes ao PREP.D-Ib foram reunidas, concentradas com sulfato de amônio a 100% de saturação e dialisadas contra o tampão de extração para utilização no passo cromatográfico seguinte. A cromatografia foi monitorada através de leituras de absorbância a 280 nm. Ao final do processo, a toxicidade para camundongos foi avaliada pelas vias ip e iv.
4.4.3.3 – Cromatografia de Exclusão Molecular em Coluna de Superdex 200 HR 10/30
Alíquotas do PREP. D-Ib (1 mg), após concentração com sulfato de amônio, filtradas em membrana de 0,45 m (Millipore), foram submetidas à cromatografia de exclusão molecular em coluna de Superdex 200 HR 10/30, equilibrada com tampão Tris-HCl 0,025 M, pH 7,5, contendo NaCl 0,5 M. O processo cromatográfico foi desenvolvido em sistema FPLC (coletor Pharmacia LKB FRAC-100). A cromatografia foi monitorada através de leituras de absorbância a 280 nm e 220 nm.
4.5 – Caracterização Físico-Química, Bioquímica e Estrutural da SYTX
4.5.1 - Determinação da Massa Molecular
4.5.1.1 – Estimativa da Massa Molecular por Eletroforese em Gel de Poliacrilamida
A massa molecular da SYTX foi estimada por eletroforese em gel de poliacrilamida, na presença de SDS, seguindo a metodologia descrita por
Laemmli (1970), adaptada para o uso de placas medindo 10 x 8 cm. O gel de aplicação encerrava 3,5% de acrilamida e 1% de SDS, preparados em tampão Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8, e o de separação 15% de acrilamida e 1,0% de SDS, em tampão Tris-HCl 3 M, pH 8,8. Amostras de SYTX (1 mg/mL) foram dissolvidas em tampão Tris-HCl 0,0625 M, pH 6,8, contendo SDS 1%, na presença ou ausência de 1% de -mercaptoetanol 1% e 20% de glicerol. As amostras foram aquecidas a 100 C, durante 10 minutos, e centrifugadas a 10.000 x g (centrífuga “Eppendorf” 541 7R), por 5 minutos, a 10 C. Aos sobrenadantes, foi acrescentado azul de bromofenol a fim de permitir visualização da corrida eletroforética. Alíquotas encerrando 20 L foram aplicadas por poço e a corrida foi conduzida a corrente constante de 20 mA, durante 2 h. As bandas protéicas foram visualizadas por revelação com prata (BLUM et al., 1987). A metodologia utilizada consistiu de várias etapas e soluções: solução de fixação (metanol 50%, ácido acético 12% e formaldeído 0,5 mL/L), solução de lavagem (etanol 50%), solução de pré-tratamento (tiossulfato de sódio 0,2 g/L), solução de impregnação (nitrato de prata 2 g/L e formaldeído 0,75 mL/L), solução de revelação (carbonato de sódio 60 g/L, formaldeído 0,5 mL/L e tiossulfato de sódio 0,2 g/L), solução de bloqueio da reação (metanol 50% e ácido acético 12%) e solução de enxágüe e acondicionamento (metanol 50%). A massa molecular aparente da toxina foi estimada a partir de uma curva padrão contruída com os Rfs dos diferentes marcadores de massa molecular utilizados.
4.5.1.2 – Determinação da Massa Molecular por Filtração em Gel
A massa molecular da SYTX foi, também, determinada por filtração em gel em coluna de Superdex 200 HR 10/30, seguindo o mesmo protocolo e condições do ítem 4.4.3.3. A coluna foi calibrada com os seguintes marcadores de massa molecular: albumina sérica bovina (67,0 kDa), ovalbumina (45,0 kDa), anidrase carbônica (29,0 kDa), inibidor de tripsina de soja tipo Kunitz
(20,1 kDa), citocromo C (12,0 kDa) e aprotinina (6,5 kDa). A massa molecular da SYTX foi calculada relacionando-se os volumes de eluição e massas moleculares dos marcadores com o volume de eluição da toxina.
4.5.2 – Determinação do Espectro de Absorção
O espectro de absorção da SYTX foi determinado em um espectrofotômetro Spectronic 7 (Pharmacia-LKB), usando uma cubeta de quartz de 1 cm de caminho óptico. A SYTX (1 mg) foi dissolvida em água grau milli-Q (1 mL), na presença e ausência de DTT 0,005 M, e a absorção verificada na região de 220 a 360 nm. O aparelho foi zerado com água, ou água contendo DTT 0,005 M, nos diferentes comprimentos de onda analisados. O coeficiente de extinção para o comprimento de onda de 280 nm foi calculado de acordo com a fórmula ε = A280/c x L onde ε = coeficiente de extinção, A280 =
absorbância no comprimento de onda de 280 nm, c = concentração da amostra e L = caminho óptico percorrido (cm). Para obtenção do ε1%, o valor obtido no
cálculo anterior foi multiplicado por 10, uma vez que foi utilizada uma solução de SYTX 0,1%.
4.5.3 – Dosagem de Carboidratos
Para avaliação da presença de carboidratos na estrutura da SYTX foi utilizado o ácido periódico de Schiff, segundo protocolo do kit de detecção de glicoproteínas (Sigma Chemical Co), após a SYTX ter sido submetida à corrida eletroforética (ítem 4.5.1.1). A visualização das bandas glicoprotéicas foi feita a olho nu, após realização das etapas estabelecidas no procedimento de coloração.
A quantificação dos carboidratos foi determinada pelo método do fenol- sulfúrico (DUBOIS et al., 1956), usando-se glicose como padrão.
4.5.4 – Determinação da Seqüência NH2-Terminal
A seqüência de aminoácidos NH2-Terminal da SYTX foi determinada
num seqüenciador automático de proteínas (Shimadzu PPSQ-23A). Para tanto, uma amostra da SYTX (1 mg/mL) foi submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS (LAEMMLI, 1970) e, em seguida, eletrotransferida através de um sistema “trans blot” (Multiphor II, Pharmacia- LKB) para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF). A eletrotransferência foi conduzida a 200 V, 80 mA, durante 2 h. Ao término, a membrana foi posta em contato com metanol para retirada do excesso de glicina presente no tampão de transferência, corada com Coomassie Briliant Blue 0,1%, para verificar a eficiência da transferência, e recortada da membrana. As tiras contendo a toxina foram descoradas com solução de ácido acético 10% e metanol 50%, lavadas exaustivamente com água grau milli-Q e, finalmente, submetida ao seqüenciamento. Os derivados feniltioidantoína dos aminoácidos (PTH-aminoácidos) foram detectados a 269 nm, após separação em uma coluna de fase reversa C18 (4,6 x 2,5 mm), conduzida sob condições
isocráticas de acordo com as instruções do fabricante. A seqüência obtida foi submetida ao alinhamento automático através do sistema NCBI-BLAST.
4.5.5 – Determinação de Atividade Quitinolítica
Para avaliação da atividade quitinásica foi realizado um ensaio colorimétrico de acordo com a metodologia descrita por Boller (1993). O parâmetro utilizado foi a liberação de N-acetil-D-glucosamina (NAG), a partir da
ação hidrolítica das enzimas sobre a quitina coloidal. Inicialmente, a atividade quitinolítica total foi determinada por incubação de 250 L de amostra (0,6 mg/mL) com 250 L de quitina coloidal (BOLLER, 1992), a 37 ºC, durante 2 h e, em seguida, fervidos em banho-maria, por 5 minutos. Os tubos, após resfriamento, foram centrifugados a 10.000 x g, 25 ºC, por 10 minutos, e alíquotas de 300 L foram retiradas e incubadas com 10 L da solução de glucoronidase (EC 3.2.1.31), a 37 ºC, por 1 h. Esta solução foi obtida por diálise da preparação bruta de Helix pomatia (Tipo HP-2, 132.000 Unidades/mL) com tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2, e diluição (10 vezes) com o mesmo tampão de reação. Nas atividades exoquitinolíticas, apenas 250 L da amostra (0,6 mg/mL) foram incubados com 250 L da quitina coloidal, a 37 ºC, por 2 h e, após esse tempo, os tubos foram fervidos por 5 minutos. Para avaliar a liberação de NAG, em ambos ensaios, 310 L do hidrolisado foram misturados com 190 L de acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2, e 100 L de tetraborato de sódio e potássio 0,6 M. Os tubos foram novamente fervidos por 5 minutos, resfriados e acrescentados de 1 mL de uma solução de ρ-dimetilaminobenzaldeído (DMAB), preparada dissolvendo-se 10 g de DMAB em 100 mL de ácido acético glacial contendo 12,5% (v/v) de ácido clorídrico 12 N. As leituras foram realizadas a 585 nm (espectrofotômetro tipo Novapesc II, Pharmacia). Para cálculo da quantidade de açúcar liberado na reação, uma curva padrão construída com concentrações variadas (0,1 a 0,5 M) de NAG foi utilizada (REISSIG et al., 1955). A atividade quitinolítica foi expressa em nKat/mgP, onde 1 nKat equivale a 1 nmol de NAG liberado por segundo.
4.5.6 – Determinação de Atividade Quitinolítica em Gel de Poliacrilamida
A atividade quitinolítica foi também avaliada em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) contendo 0,01% de glicol quitina. SDS-PAGE foi feita seguindo- se a metodologia adaptada de Schägger e Von Jagow (1987). Logo em seguida, foi empregada a metodologia para detecção da atividade quitinásica
no gel, seguindo-se o protocolo estabelecido por Trudel e Asselin (1989), com modificações. Após a corrida eletroforética, o gel ficou em contato com o tampão de renaturação (acetato de sódio 0,1 M, pH 5,2, contendo 1% de Triton X-100) por 2 h, em banho-maria, a 45 ºC. A corrida eletroforética foi conduzida em gel vertical no sistema “miniVE Electrophoresis Systems” (Hoefer Pharmacia Biotech Inc.), consistindo de um gel de aplicação (1 mm de espessura) na concentração de 15% de acrilamida. As amostras foram diluídas no tampão de amostra (2x concentrado), Tris-HCl 1 M, pH 6,8, contendo 20% de glicerol, 10% de SDS, EDTA 0,5 M, EGTA 0,2 M e 0,1% de azul de bromofenol. Em seguida, estas foram centrifugadas a 10.000 x g, 10 ºC, por 10 minutos e aplicadas no gel (10,0 x 8,0 cm). A corrida eletroforética foi realizada com corrente constante de 20 mA durante 2 h. Como controle, foi utilizada a quitinase de Streptomyces griseus. Para revelação das bandas apresentando atividade quitinolítica, o gel foi imerso, durante 5 minutos, numa solução contendo calcoflúor 0,01%. Logo após, o gel foi lavado com água grau milli-Q por 1 h, para retirada do excesso de calcoflúor. A visualização das bandas foi feita sob luz ultravioleta no sistema de vídeo documentação UV ITF LABORTECHNIK (Waaerburg, Germany).
4.5.7 – Detecção de Inibidor de Tripsina
Para determinação da atividade inibidora de tripsina foi utilizada a metodologia descrita por Kakade com algumas modificações (HAMERSTRAND et al., 1981). Alíquotas de material foram incubadas a 37 ºC, num meio de reação que consistia de 1,6 mL de Tris-HCl 0,05 M, pH 8,2, contendo CaCl2
0,02 M, 0,1 mL de tripsina (solução estoque de 0,4 mg em 10 mL de HCl 0,001 N) e o substrato BAPNA. A reação foi interrompida com 0,2 mL de ácido acético 30% (v/v) e a leitura feita a 410 nm. Os resultados foram calculados considerando a curva obtida com SBTI (padrão) e expressos como a quantidade em mg de tripsina inibida (UI) por g de farinha.
Para dissolução de 10 mg do BAPNA foram usados, primeiramente, 0,5 mL de dimetilsufóxido (99,9%) que, por sua vez, foi agitado em vortex até a solução ficar límpida. Em seguida, o volume foi completado para 1 mL com água grau milli-Q, sendo esta solução novamente agitada e usada imediatamente.
4.5.8 – Ensaio de Atividade Hemaglutinante
A SYTX foi submetida a ensaios de aglutinação de eritrócitos. A atividade hemaglutinante foi determinada segundo a metodologia descrita por Moreira e Perrone (1977), adaptada para o uso de tubos. As amostras (1 mg/mL) foram diluídas seriadamente com NaCl 0,15 M (1:2; 1:4; 1:8; 1:16; etc) e cada diluição foi misturada (1:1) com uma suspensão de eritrócitos 2% de coelho. Os tubos foram incubados a 37 C durante 30 minutos e, depois, por mais 30 minutos à temperatura ambiente. Após esse tempo, os tubos foram centrifugados a 2.000 x g, por 1 minuto, e a aglutinação visualizada a olho nu.