THE EFFECT OF VERTEPORFIN ON EPITHELIAL MESENCHYMAL TRANSITION IN HUMAN CHOLANGIOCARCINOMA CELL LINE

Çiğdem UÇAR Erciyes Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü

Biyokimya Anabilim Dalı Yüksek Lisans Tezi, Mayıs 2019 Danışman: Prof. Dr. Gülden BAŞKOL

Erciyes University, Graduate School of Health Sciences Department of Medical Biochemistry

M. Sc. Thesis, May 2019 Supervisor: Prof. Dr. Gülden BAŞKOL ÖZ

Kolanjiokarsinoma (KK), kolanjiyosit farklılaşma belir- teçlerine sahip olan epitelyal tümörlerdir. KK’nin insidans ve mortalite oranı her geçen gün artmaktadır ve ikinci en sık rastlanan primer hepatobiliyer kanser türüdür. Verteporfin, karbon atomlarına bağlı dört modifiye pirol biriminden oluşan aromatik heterosiklik, siklik moleküller içeren porfirin ailesine ait bir bileşik- tir. Verteporfin neovasküler makula dejenerasyonu ve birçok insan tümörünün tedavisinde bir fotosensitizer olarak yaygın kullanıma sahiptir. 2000 yılında da Verteporfin FDA onayı almıştır. İn vitro ve in vivo yön- temlerle yapılan pek çok çalışma ile Verteporfin’nin antikanser etkisi araştırılmıştır. Epitelyal Mezenkimal Geçiş (EMT); epitel hücrelerinin birtakım değişiklikler geçirmesi sonucunda epitel özelliklerini kaybederek mezenkimal özellikler kazandıkları önemli bir değişim sürecidir. EMT sonucunda kanser hastalığının hayati tehlike oluşturan belirteçleri ortaya çıkmaktadır. Bu çalışmada, in vitro ortamda TFK-1 hücrelerine 2 μM, 5 μM, 10 μM, 12 μM ve 15 μM konsantrasyonlarında Verteporfin uygulandı ve IC50 değeri 13 μM olarak bu-

lundu. Migrasyon deneyi yapılarak kontrol ve 13 μM konsantrasyonunda Verteporfin verilen gruplardaki yara genişlikleri, 24 satte bir ölçüldü. Deney sonucun- da, 13 μM Verteporfin verilen grupta kontrole göre migrasyonun inhibe edildiği tespit edildi. Hücre döngü- sü deneyinde Verteporfin’nin G0/G1 evresini arttırdığı, S ve G2/M evresini azalttığı görüldü. Ayrıca Verteporfin’nin EMT üzerine etkisi araştırldı. TFK-1 hücreleri 13 μM Verteporfin ile 72 saat inkübe edildi ve Western Blot yöntemiyle E-kaderin, N-kaderin ve Vimentin protein seviyeleri incelendi. Verteporfin’nin 13 μM konsantrasyonuyla muamele edilen TFK-1 hüc- relerinde, kontrole göre E-kaderin, N-Kaderin ve Vimentin proteinlerinin seviyesinde azalma gözlem- lendi. Sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0,05).

Sonuç olarak Verteporfin’nin, TFK-1 hücrelerinde migrasyonunu engellediğini ve hücreleri G0/G1 evre- sinde tutuğunu gördük . Ancak bunun yanında Verteporfin’nin EMT üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olduğunu gördük. Bu durum, Verteporfin’nin kullanımı sırasında dikkat edilmesi gerektiğini düşündürmekte- dir. Ayrıca bu konuda daha ayrıntılı çalışmalar yapılma- sının faydalı olacağını öngörmekteyiz.

ABSTRACT

Cholangiocarcinoma (CC) are epithelial tumors with features of cholangiocyte differentiation. The incidence and mortality rate of CC is increasing day by day and the second most common primer is hepatobiliary cancer. Verteporfin is a compound of the porphyrin family which contains aromatic heterocyclic, cyclic molecules consisting of four modified pyrrole units bound to carbon atoms. Verteporfin has widespread use as a photosensitizers in the treatment of neovascular macular degeneration and many human tumors. Verteporfin was granted FDA approval in 2000. Several in vitro and in vivo studies have been examined the anticancer effect of Verteporfin. Epithelial- Mesenchymal Transition (EMT); is an important change process in which epithelial cells lose mesenchymal properties by losing epithelial properties as a result of a number of changes. As a result of EMT, life- threatening markers of cancer are seen.

In this study, TFK-1 cells were treated with 2 μM, 5 μM, 10 μM, 12 μM and 15 μM Verteporfin in vitro and the IC50 value was also found to be 13 μM. Wound widths in

the control and Verteporfin groups at 13 μM concentration were measured at specified times by the migration experiment. As a result, migration was inhibited in the 13 μM Verteporfin group compared to the control. In the cell cycle experiment, Verteporfin increased the G0 / G1 phase and decreased the S and G2 / M phases. In addition, the effect of Verteporfin on EMT was investigated. TFK-1 cells were incubated with 13 μM Verteporfin for 72 hours and E-cadherin, N- cadherin and Vimentin protein levels were examined by Western Blot method. In TFK-1 cells, a decrease in the level of E-cadherin, N-cadherin and Vimentin proteins relative to control was observed. The results were statistically significant (p<0.05).

In conclusion, we found that Verteporfin inhibited migration in TFK-1 cells and held cells in G0 / G1 phase. However, we found that Verteporfin had a negative effect on EMT. This suggests that attention should be paid to the use of Verteporfin. We also anticipate that further studies in this regard will be useful.

TEZ ÖZETLERİ

Sağlık Bilimleri Dergisi (Journal of Health Sciences) 2019 ; 28 (2)

48

SÜT ve SÜT ÜRÜNLERİNDE ESCHERİCHİA COLİ O26, O111 ve O157 VARLIĞI, İZOLATLARIN ANTİBİYOTİKLERE DUYARLILIKLARI ve MOLEKÜLER TİPLENDİRİLMESİ

PRESENCE of ESCHERICHIA COLI O26,O111 and O157 in MILK and DAIRY PRODUCTS, ANTIBIOTIC SUSCEPTIBILTY and MOLECULAR TYPING of ISOLATES

Demet ÖZTEKİN Erciyes Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü

Veteriner Besin Hijyeni ve Tek. Anabilim Dalı Yüksek Lisans Tezi, Mayıs 2019 Danışman: Dr. Öğr. Üyesi Harun HIZLISOY

Erciyes University, Graduate School of Health Sciences Department of Veterinary Food Hygiene and Tech.

MSc. Thesis, May 2019

Supervisor: Ass. Prof. Dr. Harun HIZLISOY ÖZ

Bu tez çalışması; Kayseri ilindeki çiftliklerde üretilen, köy pazarlarında satışa sunulan 100 adet çiğ süt numunesin- den ve marketlerde satışa sunulan 100 adet süt ürünün- den (peynir, tereyağ, yoğurt, kefir, sütlü tatlı) izole edilen Escherichia coli O26, O157 ve O111 suşlarının varlığı, izolatların çeşitli antibiyotiklere duyarlılıkları ve molekü- ler tiplendirilmesi amacıyla yapılmıştır.

Süt ve süt ürünlerinde bulunması muhtemel E. coli’ler izole edilmiştir. Fenotipik testler ve moleküler identifikasyon testleri (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) ile izolatlar identifiye edilmiştir. İzolatların serotiplerinin belirlenmesi amacıyla PCR testleri yapılmıştır. İzolatların; nalidiksik asit, siprofloksasin, tetrasiklin, trimetoprim sulfametoksazol, amoksisilin klavulanik asit, neomisin, gentamisin, azitromisin, eritromisin ve sefazolin antibi- yotiklerine karşı direnç durumu disk difüzyon testi ve E test ile ortaya konulmuştur. İzolatların moleküler tiplen- dirilmesi amacıyla Enterobacterial repetitive intergenic consensus-PCR (ERIC-PCR) yapılmıştır.

Çalışmada izolasyon yapılan örneklerin 88’i; E. coli yö- nünden pozitif olarak tespit edilmiştir. Yapılan PCR test- leri sonucunda 88 izolattan 3’ü E. coli O157:H7, 1 izolat E. coli O26:H11 yönünden pozitif olarak tespit edilmesine rağmen, E. coli O111:H8 serotipi bulunamamıştır. E. coli serotiplerine yapılan antibiyotik duyarlılık testleri sonun- da sırasıyla eritromisin ve sefazolin %75 dirençli, neomi- sin ve amoksisilin klavulanik asite %50 dirençli, gentamisin, tetrasiklin ve trimetoprim sulfametoksazol ise %25 dirençli olarak tespit edilmiştir. Ayrıca siprofloksasin ve azitromisin izolatların %100’üne duyar- lı bulunmuştur. E test ile disk difüzyon testi sonuçlarının uyumlu olduğu tespit edilmiştir. Yapılan ERIC-PCR sonuç- larına göre izolatların genetik yönden birbirinden farklı olduğu ortaya konmuştur.

Sonuç olarak; çalışmamızda toplanan numunelerden 88 izolat E. coli yönünden pozitif bulunmuştur. Testler so- nunda üç izolatın E. coli O157:H7 ve bir izolatın da E. coli O26:H11 olarak tespit edilmesi sokak sütü kullanımının ya da hijyen kurallarına uyulmadan üretilen süt ürünleri- nin halk sağlığını olumsuz yönde etkilemesi açısından önemlidir. Antibiyotik duyarlılık testleri sonunda yüksek derecede direncin bulunması halk sağlığı açısından risk arz etmektedir. Süt ve süt ürünlerinde E. coli ve serotiplerinden kaynaklanabilecek hastalıklarla mücade- le açısından hijyenik tedbirler uygulanmalı, artan antibi- yotik direncin önlenmesi amacıyla antibiyotik kullanımı- nın kontrol altında tutulması gerekmektedir.

ABSTRACT

This thesis study; aimed to determine the presence of

Escherichia coli O26, O157 and O111 strains isolated

from 100 raw milk samples produced in farms in Kay- seri province and 100 milk products (cheese, butter, yogurt, kefir, milky dessert) offered for sale in grocery stores in the markets of Kayseri, to find out the antibi- otic resistance profiles and molecular type of isolates.

E. coli are likely to be present in milk and milk prod-

ucts. Phenotypic tests and molecular identification tests (Polymerase Chain Reaction) and isolates were identi- fied. PCR tests were performed to determine the sero- types of the isolates. the isolates; Resistance to nalidixic acid, ciprofloxacin, tetracycline, trimethoprim sul- famethoxazole, amoxicillin clavulanic acid, neomycin, gentamicin, azithromycin, erythromycin and cefazolin antibiotics was demonstrated by disk diffusion test and E test. Enterobacterial repetitive intergenic consensus- PCR (ERIC-PCR) was used for the molecular typing of the isolates.

Eighty eight of the samples were isolated; It was found to be positive for E. coli. As a result of PCR tests, 3 out of 88 isolates were found to be positive for E. coli O157: H7 and 1 isolate E. coli O26: H11, but E. coli O111: H8 serotype could not be found. Antibiotic susceptibility tests on E. coli serotypes were found to be resistant to 75% of erythromycin and cefazolin, 50% resistant to neomycin and amoxicillin clavulanic acid, and 25% resistant to gentamicin, tetracycline and trimethoprim sulfamethoxazole. In addition, ciprofloxacin and azithromycin were found to be sensitive to 100% of the isolates. E test and disk diffusion test results were found to be compatible. According to ERIC-PCR results, the isolates were found to be different from each other genetically.

As a result; 88 isolates were positive for E. coli. At the end of the tests, detection of three isolates as E. coli O157: H7 and one isolate as E. coli O26: H11 is impor- tant in terms of adversely affecting the public health of dairy products produced without using street milk or hygiene rules. The presence of a high degree of resis- tance at the end of antibiotic susceptibility tests pre- sents a risk for public health. Hygiene measures should be applied to combat the diseases that may arise from

E. coli and serotypes in milk and dairy products and

antibiotic use should be kept under control in order to prevent increased antibiotic resistance.

Anahtar kelimeler: Escherichia coli, çiğ süt, süt ürünleri,

Sağlık Bilimleri Dergisi (Journal of Health Sciences) 2019 ; 28 (2) TEZ ÖZETLERİ

49

İNSAN KOLANJİOKARSİNOMA HÜCRE HATTINDA (TFK-1) METFORMİN'İN YES-ASSOCIATED