Duyu Verisi Kuramları Türleri ve Filozofları

A obtenção de dados robustos e confiáveis a partir de um ensaio biológico está intimamente relacionada com a execução correta das técnicas envolvidas, com a padronização do ensaio em questão e com a validação dos resultados. Desta forma, durante a execução deste projeto de doutorado, foram realizadas a padronização e a otimização de métodos, que permitiram a obtenção e a validação de resultados reprodutíveis e de alta qualidade.

4.1.1 Ensaio wound healing

Para assegurar a reprodutibilidade das análises qualitativas dos ensaios wound

healing, é necessária a formação de uma monocamada celular confluente que permita

a criação da fenda. Deste modo, foi realizada a padronização do número de células por meio do plaqueamento de diferentes concentrações da suspensão celular, englobando uma faixa entre 1 x 104_{e 1 x 10}5 _{células por poço, considerando-se o}

emprego de placas de cultura de 24 poços.

As melhores concentrações encontradas para as linhagens tumorais de mama e de próstata foram, respectivamente:

- Linhagem MDA-MB-231 (carcinoma de mama): 1,0 x 105 _{células/poço.}

- Linhagem DU-145 (carcinoma de próstata): 5,0 x 104 _{células/poço.}

Também foi realizada a padronização do campo de visão a ser fotografado nos ensaios, para que este fosse exatamente o mesmo nos tempos 0 e 22 h, permitindo, desta forma, a comparação das imagens obtidas no início e no final do experimento. Para isto, foi confeccionada uma placa autoclavável que se encaixa perfeitamente embaixo da placa de 24 poços. Este acessório, com orifícios redondos alinhados com

a região central de cada poço, permitiu a incidência da luz do microscópio sempre no mesmo ponto (Figura 14).

Figura 14 - Placa metálica desenvolvida para o ensaio wound healing.A placa foi encaixada na parte inferior da placa de ensaio.Fonte: Elaborada pela autora.

4.1.2 Ensaio quantitativo de migração celular (câmara de Boyden)

Os insertos utilizados no ensaio de migração celular são fundamentais para a obtenção de bons resultados. Diferentes tipos de material estão disponíveis comercialmente, possibilitando sua adequação ao modelo experimental em questão. No caso dos ensaios de migração celular com as células MDA-MB-231, os insertos com membranas transparentes, com quantidade menor de poros em sua superfície, produziram melhores resultados na contagem de células, quando comparados aos insertos com membranas translúcidas. Desta forma, adotou-se como padrão o emprego de membranas transparentes nos ensaios quantitativos.

Para a otimização da análise dos resultados, a contagem de células foi automatizada empregando-se o software NIS elementsTM_{,ajustando-se os parâmetros}

de quantidade de luz incidida e os valores de delimitação de área.

A Figura 15 mostra uma fotomicrografia da membrana do inserto após fixação e coloração das células no ensaio de câmara de Boyden. As células que migraram para a porção inferior do inserto aparecem coradas em roxo (à esquerda). Através do

ajuste correto do software, elas foram destacadas em vermelho e contadas automaticamente.

Figura 15 - Contagem automática de células na membrana. À esquerda fotomicrografia da membrana do inserto com as células coradas. À direita a marcação das células, para a contagem automática (software:NIS elements). Fonte: Elaborada pela autora.

4.1.3 Padronização de ensaio de proliferação celular

Os ensaios de proliferação celular baseiam-se na propriedade do composto tetrazólio [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfophenyl)-2H- tetrazolio] (MTS) (Figura 16) de ser biorreduzido pelas células viáveis,resultando em um produto colorido chamado formazan, que é solúvel em meio de cultura. A detecção é feita por monitoramento em espectrofotômetro, o que permite a determinação da porcentagem de células viáveis presentes no meio.

Figura 16 - Estrutura do MTS tetrazolio e seu produto formazan.Fonte: Elaborada pela autora.

Para a padronização do número de células a ser utilizado nos ensaios, foi realizado um experimento para a análise da variação da absorbância em função do número de células. Células de tumor de mama MDA-MB-231 e MCF-7 foram adicionadas à uma placa de cultura de 96 poços, abrangendo uma faixa de concentração de 1,0 x 103 _{células/mL a 1,0 x 10}5 _células/mL.

Após o período de adesão celular de 24 h, 20 µL do reagente MTS foram adicionados e a absorbância foi monitorada em comprimento de onda de 490 nm, em intervalos de 30 min, por um período de 4 h. A semelhança das curvas referentes às medidas nos tempos de 2,5 h e 3 h, mostradas nas Figuras 18 (MDA-MB-231) e 19 (MCF-7), revelou a estabilização da absorbância após este período de tempo. A partir deste resultado, padronizou-se um período de incubação de 3 h para a leitura dos resultados, garantindo deste modo, a biorredução completa do MTS para a avaliação da citotoxicidade dos compostos.

Figura 17 - Curvas representando a variação da absorbância em função do número de células, variando-se o tempo de incubação do experimento. Fonte: Elaborada pela autora.

Figura 18 - Curvas representando a variação da absorbância em função do número de células, variando-se o tempo de incubação do experimento. Fonte: Elaborada pela autora.

O ensaio de proliferação requer um determinado período de tempo para que ocorra o crescimento celular. Desta forma, deve-se garantir que ao final do experimento, a absorbância medida ainda sofra variação em função do número de células vivas, ou seja, a absorbância ainda não deve ter atingido um platô. Portanto, para a obtenção das curvas de absorbância x número de células, a quantidade de células utilizadas deve ser padronizada, para que haja uma relação direta entre estes dois parâmetros.

Observou-se que para as duas linhagens celulares, uma concentração acima de 6,0 x 103 _{células /poço não é capaz de alterar o sinal de absorbância (Figura 19).}

Desta forma, para evitar que a absorbância atingisse o platô, uma concentração de 4,0 x 103 _{células/poço foi selecionada para a realização dos experimentos.}