Su duvarının genel özellikler

O rAaTI purificado foi testado quanto à capacidade de inibir as tripsinas digestivas de intestino de larvas de 4° instar, intestino de fêmeas adultas não alimentadas e 3 e 24 h após a alimentação. O rAaTI foi capaz de inibir fortemente as enzimas digestivas de larvas de 4° instar e de intestino de fêmeas não alimentadas e 24 h após alimentadas, porém não foi efetivo na inibição das enzimas digestivas de fêmeas 3 após alimentadas com sangue (figura 22).

A)

B) C)

Figura 22 – Ensaios de inibição de tripsinas digestivas de diferentes fases do mosquito

Ae. aegypti por rAaTI. (A) extrato de intestino de fêmeas adultas não alimentadas, (B) 3 h e

(C) 24 h após a alimentação com sangue. Os extratos foram pré-incubados com rAaTI em diferentes concentrações. O substrato sintético utilizado foi o Tosyl-Gly-Pro-Arg-AMC (100

60 40 20 0 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 [rAaTI]/nM A ti v ida de r es idua l de t ri ps in a - ext rat o 3 h Ki = 693 nM 60 40 20 0 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 [rAaTI]/nM at iv id a de re s idua l de t ri p s in a - ext rat o 24 h Ki = 4,2 nM Ki = 1,5 nM

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5 DISCUSSÃO

Os inibidores de serinoproteases do tipo Kazal possuem papel importante no controle de processos em que serinoproteases estão envolvidas, como por exemplo, na digestão e na coagulação sanguínea.

Um grupo de animais que apresenta necessidade vital em controlar o sistema hemostático de animais vertebrados é o grupo dos animais hematófagos. Dentre estes, temos os insetos se destacando por transmitirem doenças aos seus hospedeiros durante a aquisição de sangue. Os insetos hematófagos produzem moléculas que interferem em diversos mecanismos para superar o sistema hemostático do hospedeiro. A maioria dos anticoagulantes descritos foi isolada tanto da saliva quanto do intestino de insetos hematófagos e são em grande parte inibidores de enzimas proteolíticas da cascata da coagulação sanguínea.

O objeto deste trabalho foi o mosquito Ae. aegypti, conhecido pelo seu papel

na transmissão da Dengue. Em 2007, Ribeiro e colaboradores descreveram um inibidor de serinoproteases do tipo Kazal hipotético no transcriptoma de glândula

salivar do mosquito Ae. aegypti, cuja especificidade ainda era desconhecida (Ribeiro

et al., 2007). Tendo em vista a experiência do nosso laboratório em caracterizar

inibidores de proteases, o objetivo desse trabalho foi expressar, purificar e caracterizar o inibidor – denominado por nós de rAaTI e sua forma truncada, denominada rAaTI∆.

Inicialmente, foi realizado um alinhamento da sequência de aminoácidos de rAaTI com outros inibidores do tipo Kazal, os inibidores com maior similaridade ao AaTI foram inibidores putativos encontrados em transcriptomas de outros mosquitos,

no entanto, quando comparado à outras sequências de inibidores tipo Kazal já caracterizados, as similaridades foram maiores com inibidores de trombina: dipetalogastina (Mende et al, 1999), brasiliensina (Araujo et al., 2007) e inibidor de

Fator XIIa, infestina 4 (Campos et al. 2004); um inibidor presente em hemócito de

Litopenaeus vannamei (Jiménez-Vega & Vargas-Albores, 2005); e inibidor de triptase

de sanguessuga Hirudo medicinalis (Sommerhoff et al., 1994). Este resultado

confirma que AaTI apresenta um domínio Kazal, e que na posição P1 do sítio reativo encontra-se um resíduo de Arg, sugerindo que este poderia inibir enzimas do tipo tripsina e até mesmo a trombina, visto a sua semelhança com brasiliensina e dipetalogastina, inibidores de trombina provenientes de insetos hematófagos e que apresentam dois domínios Kazal em tandem. Visto que o AaTI apresentam apenas um domínio Kazal surgiu a dúvida da sua possível função de inibir trombina pois há diferentes maneiras de inibir esta enzima (Grütter et al., 1990; van de Locht et. , 1995; Arocas et al., 1996; Fuentes-Prior et al., Richardson et al., 2000)

A fim de obtermos o AaTI recombinante, o mesmo foi clonado em vetor pPIC9

e expresso em sistema de Pichia pastoris. De posse do inibidor purificado e sua

seqüência de aminoácidos confirmada por Degradação de Edman, a atividade inibitória de rAaTI foi analisada sobre diversas serinoproteases, o AaTI foi capaz de inibir a atividade amidolítica da tripsina (Ki 0,15 nM ), plasmina (Ki 1,9 nM) e fracamente a trombina. Estes resultados confimam a função de AaTI como inibidor de serinoproteases do tipo Kazal, lembrando que até o presente momento, o mesmo só havia sido relatado ao nível de transcrição. A atividade anticoagulante de rAaTI ainda era uma duvida pois a sua atividade inibitória sobre a trombina não é tão forte quando comparada à tripsina ou plasmina.

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É importante ressaltar que a trombina é uma enzima chave da cascata da coagulação e apresenta três regiões funcionais: o sítio ativo, exosítio I e exosítio II, e que inibidores específicos de trombina já descritos apresentam mecanismos de inibição que necessitam interagir com pelo menos duas regiões funcionais da trombina, como por exemplo, a rodinina, um inibidor do tipo Kazal (van de Locht et al.,

1995) que inibe a trombina através da ligação ao exosítio I e sítio ativo da enzima. Similarmente à rodinina, outros inibidores atuam pelo mesmo mecanismo, como por exemplo, a hirudina (Grütter et al., 1990) e a ornitodorina (van de Locht 1996). O AaTI

poderia ser um inibidor forte de trombina contendo apenas um domínio tipo Kazal, ligando-se, por exemplo, em um dos dois exosítios, já que não inibe fortemente a atividade amidolítica da trombina. Os nossos resultados de inibição de trombina, somados às informações da literatura de outros inibidores fortes de trombina, como

por exemplo, a triabina (Noeske-Jungblut et al., 1995) que liga-se somente no

exosítio I da trombina e a hemadina (Richardson et al., 2000) que liga-se somente ao

exosítio II, e a botrojaracina (Arocas et al., 1996) que interage com o exosítio I e

exosítio II, porém não se liga ao sítio ativo, sugerem que o AaTI pode ser um inibidor de trombina. Portanto na tentativa de confirmar esta hipótese o inibidor recombinante foi utilizado em testes de coagulação do plasma ou fibrinogênio.

O rAaTI foi capaz de prolongar o tempo de trombina (TT), tempo de protrombina (TP) e tempo de tromboplastina parcialmente ativada (TTPA), confirmando a interação com a trombina, no entanto, as concentrações utilizadas nos ensaios foram na ordem de µM, sugerindo se um inibidor fraco de trombina. Como há diferentes maneiras de inibição de trombina, surgiu a dúvida de qual seria a região do AaTI responsável pela sua atividade sobre trombina, pois ao analisarmos a sequência

de aminoácidos fica evidente a presença de uma cauda C-terminal carregado negativamente, pela qual o AaTI poderia interagir com um dos exositios da trombina que são carregados positivamente (Bode, 2006). A fim de entender o mecanismo de inibição do AaTI foi sintetizado um peptídeo contendo a sequência de aminoácidos C- terminal carregado do inibidor (pI teórico= 3,3), e paralelamente, expressou-se o rAaTI

na forma truncada, sem a cauda ácida em sistema P. pastoris. O rAaTI∆ purificado

não foi capaz de inibir a atividade amidolitica da trombina, inibiu apenas tripsina e plasmina. O rAaTI∆ (0,35 µM) e o peptídeo sintético (0,72 µM) foram utilizados nos testes de coagulação, e ambos foram capazes de prolongar o TT, sugerindo que as duas formas (e não somente a cauda ácida) possuem um efeito sobre a trombina.

Paralelamente aos ensaios de coagulação, também foram realizados ensaios de agregação plaquetária, com o objetivo de definir em que sítio da trombina o inibidor estaria se ligando, já que inibidores que se ligam apenas no exosítio I da trombina são capazes de inibir a agregação plaquetária induzida por trombina (Ciprandi et al, 2006), porém o rAaTI e o peptídeo não foram capazes de inibir a agregação, sugerindo então que o rAaTI não se liga ao exosítio I da trombina. E, portanto, poderia se ligar ao exositio II e ao sitio ativo.

Para confirmarmos este dado, foram realizados ensaios de competição pelo exosítio I e pelo exosítio II da trombina. No ensaio de competição pelo exosítio I, foi formado o complexo rAaTI com trombina, em seguida foi adicionado hirudina (inibidor que se liga no sítio ativo e no exosítio I da trombina) (Grütter et al., 1990) em diferentes concentrações. Finalmente o substrato fluorogênico foi adicionado, e foi medida a atividade residual da trombina. Como controle foi feita uma curva de inibição utilizando hirudina na ausência de rAaTI. Para verificar se a hirudina é capaz de

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interferir na inibição do rAaTI, a trombina foi incubada com hirudina, e foram adicionadas concentrações diferentes de rAaTI (figura 18), porém não observados diferença entre as curvas de inibição, reforçando que o rAaTI não se liga no exosítio I da trombina.

No caso do ensaio de competição pelo exosítio II, foi formado o complexo trombina e antitrombina III na presença de heparina, e em seguida foi realizada uma curva de inibição utilizando rAaTI e finalmente o substrato fluorogênico Tosyl-Gly-Pro- Arg-AMC foi adicionado. A heparina se liga ao exosítio II da trombina e é capaz de potencializar o efeito da antitrombina III. Como controle, foi realizada uma curva de rAaTI na ausência de antitrombina III. Foi verificado que comparando estas duas curvas (figura 19), notou-se uma maior inibição da trombina pelo rAaTI na presença de antitrombina III e heparina. Com estes resultados, surge a duvida se e um efeito cooperativo entre antitrombina/heparina e rAaTI ou a concentração de trombina livre do ensaio e muito baixa e portanto o rAaTI foi capaz de inibir apenas a enzima livre (2,12 pM), para simular estas condições, foi utilizada uma trombina diluída (2,12 pM) em um ensaio de inibição com rAaTI (0-1,3 µM) e verificou-se que a atividade inibitória do rAaTI era semelhante de quando a trombina estava parcialmente inibida pela antitrombina III. Isto sugere que o rAaTI liga-se em alguma região ocupada pela heparina ou pela antitrombina III, e a sua interação com a trombina é mais fraca, portanto, ele não consegue deslocar a antitrombina ou a heparina. Como o rAaTI só inibiu a atividade amidolítica da trombina em concentrações muito elevadas, confirmando a sua baixa especificidade para trombina, outra hipótese é que as concentrações de rAaTI para inibir a enzima devem ser elevadas para observarmos a inibição de trombina que deve ser majoritariamente via sitio ativo da enzima visto que

o inibidor truncado também foi capaz prolongar o tempo de trombina. E o efeito do peptídeo pode não ser especifico, visto que diferentes peptídeos carregados negativamente podem interferir na ligação da trombina com o fibrinogênio, como por exemplo o hirugen, que corresponde ao fragmento de ligação ao exosítio I da hirudina (resíduos 54-65) (Ng et al., 2009; Skrzypczak-Jakun et al., 1991).

Os resultados mostrados, nos permitem concluir que o AaTI pode ser um anticoagulante do Ae. aegypti, no entanto, não parece ser o mais importante visto que

não e um inibidor forte de trombina, no entanto, não podemos descartar que in vivo

esta molécula atue sinergicamente com outras do hospedeiro ou do próprio mosquito, o que aumentaria a sua especificidade sobre a trombina.

Paralelamente a caracterização de AaTI como anticoagulante foi realizado uma análise de transcrito do AaTI para determinar em que tecido o AaTI estaria sendo expresso, e o mesmo foi encontrado em glândula salivar e intestino de fêmeas e adultas 3 e 24 h após a alimentação com sangue. Sugerindo que, como anticoagulante, o AaTI poderia atuar na saliva e no intestino, como outros inibidores de proteases com atividade anticoagulante descritos em intestino de insetos

hematófagos, com a infestina 1-2 (Campos et al., 2002) e a dipetalogastina (Mende et

al., 1999).

Na tentativa de confirmar a presença do inibidor nativo foi realizado um

experimento de Western blotting com extratos de glândulas salivares e intestinos de

fêmeas 3 e 24 h após a alimentação com sangue, porém não foi possível confirmar a presença de uma banda de proteina no tamanho esperado para AaTI em glândulas salivares, talvez pela baixa concentração do inibidor presente neste tecido, entretanto bandas com massas moleculares maiores foram identificadas, sugerindo a presença

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de outras proteinas com domínios Kazal similares ao AaTI na glândula salivar, ou sejam apenas bandas inespecíficas. Por outro lado, proteinas com massa molecular correspondente ao AaTI foram visualizadas nos extratos de intestinos de fêmeas 3 e 24h após alimentação com sangue. O extrato de glândula também foi testado nos ensaios de coagulação e nos ensaios de inibição de tripsina, mas também não foi observado o efeito do rAaTI (dados não mostrados).

Um resultado intrigante foi a presença de transcrito de AaTI em larvas de 1° a 4° instar, em pupa, e de acordo com o Dr. J.M. Ribeiro et al. (2007), o transcrito também foi encontrado em machos (Ribeiro et al., 2007). Como o AaTI recombinante apresentou inibição da atividade amidolítica da tripsina bovina, e através da análise

de transcrito e por Western blooting comprovamos a presença do inibidor nativo em

intestino de fêmeas, decidiu-se verificar a possível função de AaTI na inibição de enzimas digestivas tipo tripsina nos diferentes estágios de desenvolvimento.

O rAaTI mostrou-se efetivo em inibir as tripsinas de: larva de 4° instar com um

Ki de 0,9 nM (Sanches et al., submetido para publicação), as tripsinas de fêmeas

adultas não alimentadas, com um Ki aparente de 1,5 nM e as tripsinas de fêmeas 24

h após a alimentação, com um Ki aparente de 4,2 nM, porém não foi eficiente em

inibir as tripsinas de fêmeas 3 h após a alimentação, mostrando uma diferença de especificidade para as diferentes tripsinas. A presença do transcrito em larvas de Ae. aegypti sugere uma outra função para o rAaTI, diferente da ação anticoagulante, já

que as larvas não se alimentam de sangue, e o rAaTI não interfere nas tripsinas

presentes em intestino de fêmeas 3 h após alimentadas (Noriega et al., 1996a),

indicando que o rAaTI não interfere no início da digestão do sangue, ou ainda que não inibe as tripsina precoce mas que pode controlar a atividade das tripsinas tardias.

Em conclusão, o presente trabalho confirma a função do AaTI descrito no

transcriptoma de glândula salivar do mosquito Ae. aegypti como um inibidor de

serinoproteases do tipo Kazal, o primeiro a ser descrito como inibidor presente

glândula salivar de mosquitos. O AaTI é um inibidor fraco de trombina, e portanto, é

um anticoagulante fraco de glândula salivar e intestino de Ae. aegypti, segundo

nossos dados de transcrição. E, paralelamente a sua ação anticoagulante, o AaTI deve participar na modulação de tripsinas endógenas do mosquito nas diferentes fases larvais e na fêmea adulta no final da digestão do sangue.

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6 RESUMO

O mosquito Ae. aegypti é o vetor clássico da febre amarela e do dengue. Em

insetos hematófagos, a digestão do sangue é realizada por enzimas proteolíticas, que também podem estar envolvidas na relação parasita-vetor. O processo de alimentação com sangue requer que os artrópodes hematófagos sejam capazes de inibir as defesas hemostáticas do hospedeiro, como por exemplo, com a presença de inibidores das enzimas da cascata da coagulação.

Com a finalidade de conhecer melhor sobre a biologia do vetor do dengue, o objetivo deste trabalho foi a expressão e a caracterização de um inibidor de serinoproteases do tipo Kazal presente em mosquito Ae. aegypti. Para isso, o inibidor

recombinante (rAaTI) e sua forma truncada rAaTI∆ (sem a região C-terminal) foram

expressos em sistema Pichia pastoris e purificados por cromatografia de afinidade. O

rAaTI purificado foi capaz de inibir a atividade amidolítica da tripsina, plasmina e fracamente a trombina. O rAaTI foi também capaz de prolongar o tempo de coagulação, e há indícios que o inibidor se ligue em alguma região ocupada pela heparina ou pela anitrombina III. O análise do transcrito mostrou que o AaTI está presente na glândula salivar e em intestino de fêmeas 3 e 24 h após a alimentação com sague, e também em todos os estádios larvais, em pupa e em machos, o que sugere que este inibidor possa ter outras funções no desenvolvimento do mosquito.

O rAaTI ainda foi capaz de inibir fortemente as tripsinas de larva de 4° instar, e tripsina de fêmeas 24 h após a alimentação, sugerindo que também possa estar envolvido com a modulação destas enzimas na fase larval e no final da digestão com sangue.

7 ABSTRACT

The Aedes aegypti mosquito is the classic vector of yellow fever and dengue

fever. In haematophagous insects, blood digestion is carried out by proteolitic enzymes, which can also be envolved in parasite-vector relationship. Blood feeding requires that haematophagous insects are able to inhibit host hemostatic defenses, containing inhibitors of coagulation cascade enzymes, for example.

In order to understand the vector bilogy, the aim of this work was expression and characterization of a Kazal-type serine protease inhibitor present in Aedes aegypti

mosquito. Recombinant inhibitor (rAaTI) and its truncated form rAaTI∆ (without C-

terminal region) were expressed in Pichia pastoris system and purified by affinity

chromatography. Purified rAaTI was able to inhibit amidolytic activity of trypsin, plasmin and weakly inhibited thrombin. rAaTI was also able to prolong coagulation time, and there are evidences that inhibitor bind in some region occupied by heparin or antithrombin III. Transcription analyzes showed that AaTI is present in salivary gland and midgut of females 3 and 24 h after blood feeding, and in all larval instars, pupae and males, which suggest that inhibitor may have other functions in mosquito development.

rAaTI was also able to strongly inhibit trypsin from 4th instar lavae , and female trypsin 3 and 34 h after blood feeding, suggesting that rAaTI may be involved in trypsin modulation in larval phase and in the end of blood difgestion.

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