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Utilizando as melhores condições experimentais anteriormente definidas, construiu-se curva de calibração para o NP em B-R pH 4,0 com eletrodo modificado com PLL:GA. As adições do composto foram efetuadas em um becker contendo B-R pH 4,0 onde, após adições de alíquotas previamente calculadas de uma solução de trabalho do NP, o eletrodo foi submetido a imersão e agitação por um período de cinco minutos. Completado este período, o eletrodo após lavagem com água bidestilada, foi conectado à célula eletroquímica contendo somente B-R pH 4,0. Os respectivos voltamogramas obtidos são mostrados na Figura 57A. Os resultados mostram que o primeiro pico aumenta em função do aumento da concentração de NP. A correspondente curva analítica é mostrada na Figura 57B.

A Figura 57B mostra que o primeiro processo de redução do NP aumenta linearmente com a concentração no intervalo de 1,21x10-6 _{a 2,06x10}-5 _{mol L}-1_{, segundo}

a equação: i (µA)= -0,120+2,251x105_{, C (onde C concentração em mol L}-1_{). Em}

concentrações mais elevadas observa-se um patamar indicativo de saturação dos sítios disponíveis no polímero. A curva relativa ao segundo processo de redução do NP apresenta duas relações lineares. Deste modo, o segundo pico torna-se inviável para determinação analítica. Esta curvatura também foi observada por LEEUWENKAMP e colaboradores [129]. O limite de determinação foi obtido em 4,62x10-7 mol L-1 através da relação sinal ruído [231].

A repetibilidade do sinal voltamétrico foi realizado através da imersão do eletrodo modificado em um becker contendo 1,00x10-4 mol L-1 de NP e submetido a agitação por 15 s e leituras de corrente, (µA), na cela contendo somente B-R pH 4,0. Os resultados, expressos em valores estatísticos, [230,231], são: ipc (µA)= 11,2±0,458 e

coeficiente de variação de 4,08% (n= 10). Entre cada medida, o eletrodo modificado foi submetido à amostragem por 15 s na solução contendo NP.

Figura 57A: Efeito da concentração sobre os voltamogramas correspondentes à redução do NP em B-R pH 4,0 sobre eletrodo modificado por filmes de PLL:GA. Curvas: (1) 1,21x10-6_{; (2) 2,43x10}-6_{; (3) 3,64x10}-6_{; (4); 6,07x10}-6_{; (5) 8,50x10}-6 _{e (6) 1,09x10}-5 _(mol

L-1 de NP). (B): Curvas (1) curva analítica para o pico I e (2) (picoII). υ=100mV s-1_.

3.4.4 – APLICAÇÃO DO MÉTODO EM FLUIDOS BIOLÓGICOS. 3.4.4.1 – PLASMA SANGUÍNEO.

A aplicação da presente metodologia em plasma sanguíneo foi realizada através da coleta de sangue de voluntários extremamente saudáveis e tratado de acordo com os procedimentos descritos na seção experimental. Alíquotas desta amostra contendo 3,66x10-6 mol L -1 de NIPRIDE® (BIOLAB), calculada após diluição da amostra, foram adicionadas em um becker contendo B-R pH 4,0. O eletrodo de trabalho, após modificação, foi imerso no becker e submetido a agitação por cinco min. Completado este período, foi removido, lavado e conectado à célula eletroquímica contendo somente B-R pH 4,0 seguido de obtenção de registro das curvas voltamétricas. Posteriormente, adições de alíquotas previamente calculadas de uma solução de trabalho de NP foram

-500 -400 -300 -200 -2 0 I pc1 / µ A i I 1 2 3 4 5 6

I / µ

A

B

A

adições do padrão [231]. Entre a obtenção de cada curva, o filme de PLL:GA foi removido e substituído por um novo com as mesmas características, para evitar que os componentes endógenos desta matriz interferissem no ensaio. Os resultados deste ensaio são mostrados na Figura 58.

A referida figura mostra que a adição das alíquotas da solução de trabalho de NP sobre o plasma sanguíneo, fortificado com a formulação hospitalar, aumenta o sinal do composto proporcionalmente sugerindo que o filme de PLL:GA apresenta seletividade compatível com aquela esperada para análise em fluido biológico sem necessidade de extração previa. Recuperação de 95,0% foi observada pelo método das adições do padrão, [231]. Estes resultados mostram que o composto pode ser analisado pelo procedimento proposto para monitoramento dentro dos níveis plasmáticos, uma vez que, após administração do hipotensor, 90% se encontra exclusivamente no plasma em níveis de concentração entre 4,63x10-7 a 4,63x10-6 mol L-1 [129]. Desta forma, o presente ensaio voltamétrico contempla esta exigência e se mostra adequado para fins analíticos.

Figura 58: Método das adições do padrão para a determinação de NP em plasma sanguíneo contaminado por 3,66x10-6 _{mol L} -1 _{de NIPRIDE}® _{transferido para B-R pH}

4,0 e medido com eletrodo de carbono vítreo modificado por filmes de PLL:GA.

-6,0x10-6 -3,0x10-6 0,0 3,0x10-6 6,0x10-6 9,0x10-6 1,2x10-5 0 1 2 3 4 3,47x10-6 _{mol L}-1 Ipc1 / µ A NP mol L-1.

A aplicação da metodologia proposta em urina humana foi realizado após a coleta recente do material biológico e preparado pela tomada de uma alíquota de 1,00 mL da amostra biológica adicionada em um balão volumétrico de 10 mL. Posteriormente, esta amostra foi fortificada com 1,00x10-3mol L-1 NIPRIDE® (BIOLAB), seguido à marca com água bidestilada. O procedimento para o ensaio segue o modelo descrito para o plasma. Os resultados são mostrados na Figura 59.

Figura 59: Método das adições do padrão para a determinação de NP em urina humana contaminado por 3,66x10-6 mol L -1 de NIPRIDE® transferido para B-R pH 4,0 e

medido com eletrodo de carbono vítreo modificado por filmes de PLL:GA.

Os resultados obtidos pela aplicação do presente ensaio em urina humana através dos procedimentos anteriormente descritos também mostraram a viabilidade de sua aplicação uma vez que índices de 96,2% de recuperação para o composto analisado foram obtidos nesta matriz biológica.

A metodologia espectrofotométrica para análise de NP em fluidos biológicos adotada foi baseada em procedimento descrito [114] e [231]. Segundo a referida

-6,0x10-6 -3,0x10-6 0,0 3,0x10-6 6,0x10-6 9,0x10-6 0,0 0,9 1,8 2,7 3,52x10-6 mol L-1 . Ipc1 / µ A NP / mol L-1

derivatização com N-(1-naftil)etilenodiamino e sulfadiazina em meio ácido. O produto da reação é um composto azo que apresenta pico bem definido em λ= 544nm. Os resultados deste estudo são mostrados na Figura 60.

Figura 60A: Espectros de absorção do produto derivatizado do NP. Curvas (1) 8,30; (2) 16,0; (3) 33,0; (4) 66,0; (5) 100 e (6) 130 (µ mol L-1_{) NP, respectivamente.}

(B): curva analítica obtida dos espectros em (A).

Pelo procedimento acima descrito é possível construir curva analítica para a determinação de NP, com linearidade na faixa de concentração entre 8,30 a 130 µmol L-1_{,segundo a equação A= εbC= 0,084+0,008 C, onde: A absorbância (544nm), ε}

absortividade molar, b caminho óptico e C concentração µ mol L-1_{, R= 0,999 (n=6).}

3.4.5 – APLICAÇÃO DO MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO PARA