Após avaliar se os microrganismos alvos são susceptíveis ao composto testado, é necessário encontrar a menor concentração capaz de inibir o crescimento microbiano (ação bacteriostática). Os testes de diluição em caldo (macro e microdiluição) são consolidados por sua eficácia e eficiência. O teste de microdiluição em caldo consiste em testar diluições seriadas de um composto em placa de 96 poços e pela verificação visual determinar a menor concentração que não apresentou crescimento, sendo, esta a concentração inibitória mínima, como o controle visual pode ser dificultado pela turvação do meio de cultura na presença da nanoemulsão, após o tempo necessário para leitura visual, uma alíquota de corante de células foi colocada em todos os poços para facilitar a identificação de crescimento bacteriano, a concentração inicial escolhida foi a correspondente a diluição 3% (v/v) do teste de susceptibilidade por ser a mais baixa concentração testada e ter sido considerada satisfatória.
Na figura 72 é possível verificar que apenas o controle negativo no poço 11 (sem presença de nanoemulsão de triclosan (T)) demonstra crescimento, ocorreu inibição do crescimento desde a mais alta até a mais baixa concentração de 0,075 e 0,000147 mg/mL, a concentração mínima inibitória (CMI) é considerada como sendo a anterior à menor concentração sem crescimento (sub-CMI), sendo portanto de 0,293 μg/mL, correspondente a 0,018% (v/v) da nanoemulsão de triclosan (T) sem diluição. Valores de CMI entre 25 e 100 mg/mL de composto já podem ser relacionadas à alta atividade inibitória (DUARTE et al., 2003), Zhang et al. (2014) compararam D-limoneno puro e nanoemulsificado e provaram que a nanoemulsificação reduziu o valor de CMI para E. coli de mais de 5 mg/mL para 1 μg/mL, e o efeito de potencialização já foi considerado quando a redução contra outras bactérias reduziu de 1 para 0,6 μg/mL.
Figura 72: Avaliação visual de crescimento pela técnica de microdiluição seriada, onde poços
de coloração roxa indicam crescimento bacteriano. Legenda: poço 11 – controle negativo, poço 12 – controle positivo, demais poços correspondem as diluições seriadas da nanoemulsão de triclosan, começando em 75 μg/mL no poço. A e B – E. coli, C e D – S. enteritidis e E e F – S. aureus.
Considerando que o objetivo principal da tese era obter uma nanoemulsão capaz de eliminar (destruir) toda população dos microrganismos testados, e não apenas estagnar seu crescimento, é de extrema importância esclarecer se o composto possui também atividade bactericida, e, se sim, qual sua concentração mínima bactericida, ou seja, a menor concentração capaz de destruir uma população conhecida do microrganismo alvo. Após semear as alíquotas de todos os poços em placas contendo meio Müller Hinton, e observar a ausência de crescimento, foi possível definir o valor de CIB como 37,5 μg/mL, valor este, considerado muito baixo, indicando alto potencial antibiótico, não só na assepsia, mas,
concentração inibitória mínima (CMI) e concentração inibitória bactericida (CIB) foram repetidos nos mesmos intervalos de tempo do teste de estabilidade ao armazenamento ao longo do tempo, para as duas temperaturas de armazenamento, com e sem filtração. Nos testes de concentração inbitória mínima verificou-se que a atividade antibacteriana se mantém mesmo com a diminuição do tamanho médio de gota em decorrência da cristalização do triclosan armazenado a 4 ºC. Não houve diferença significativa (p>0,05) nos tamanhos dos halos ao longo de todo período de estocagem (90 dias), garantindo que o princípio ativo continua dentro da gota sendo liberado sem interferências, assim como, a nanoemulsão armazenada em temperatura ambiente também manteve os mesmos valores de halo de inibição por todo período testado, os valores de CMI se mantiveram inalterados, mas, ao final do tempo de armazenamento (90 dias), para a nanoemulsão de triclosan armazenada a 4 ºC os valores de CIB diminuíram para 18,75 μg/mL (Figura 73).
A hipótese de difusão do princípio ativo pela fase contínua sob a forma de micelas poderia explicar esse aumento de atividade, pois, a gota atua como carreador, e, se o mecanismo de maturação de Ostwald causou a presença de pequenas gotas, consequentemente, potencializou a atividade antibacteriana em função da diminuição do tamanho médio de gota por possibilitar maior área de contato com a parede celular bacteriana. O aumento de ativo na forma de micelas de tensoativo auxilia no ataque direto à membrana celular. Estes resultados endossam a viabilidade do uso da nanoemulsão de triclosan como sanitizante e bactericida.
Figura 73: Visualização de crescimento dos poços de concentração inibitória mínima para
8. Conclusão
Nanoemulsões de eugenol, triclosan e extrato de pimenta dedo-de-moça foram desenvolvidas por duas etapas de processos de alta energia (homogeneizador de alta velocidade e homogeneizador de alta pressão);
Fase oleosa contendo tensoativos lipofílicos vertida sob fase aquosa contendo tensoativos hidrofílicos acarretou em emulsões com menor quantidade de espuma e melhor homogeneidade;
Baixas quantidades de fase oleosa auxiliam na redução no tamanho médio de gota e a relação ideal tensoativo/óleo foi de 1:2 (m/m);
Nanoemulsões contendo eugenol tiveram menor tamanho médio de gota, possibilitando a produção de uma nanoemulsão com tamanho médio de gota < 100 nm, devido às propriedades de co-tensoativo do eugenol;
A escolha ideal da temperatura de pré-emulsificação foi fundamental a formação de emulsões brutas com menor cremeação e formação de espuma;
O aumento gradual de tempo e velocidade de agitação em homogeneizador de alta velocidade foi crucial para reduzir o tamanho médio de gota de 1000 para 300 nm da emulsão bruta de todos os princípios ativos estudados;
Foi possível produzir nanoemulsões com tamanho médio de gota < 300 nm com homogeneizador de alta velocidade, otimizando as variáveis de processo e de composição;
As gotas das nanoemulsões de eugenol, triclosan e extrato de pimenta dedo-de-moça tiveram formato esférico e boa homogeneidade de tamanhos;
O comportamento das nanoemulsões com o mesmo princípio ativo, mas, diferentes tamanhos médios de gota, foi distinto frente aos testes de estabilidade térmica;
Todas as nanoemulsões foram estáveis à força centrífuga até 3050 G;
O principal mecanismo de instabilidade das nanoemulsões foi o maturação de Ostwald, porém, a atividade antibacteriana da nanoemulsão de triclosan (T) se mantém alta por todo período estudado, mesmo com alterações no tamanho médio de gota;
Todas as nanoemulsões foram estáveis pelo período de 90 dias quando armazenadas em temperatura ambiente;
A nanoemulsão de extrato de pimenta dedo-de-moça (P) exibiu fraca atividade antioxidante e nenhuma atividade antibacteriana;
A nanoemulsão de eugenol (E) exibiu alta atividade antioxidante e nenhuma atividade antibacteriana;
A nanoemulsão de triclosan (T) exibiu forte atividade bacteriostática e bactericida em baixas concentrações, sendo de grande interesse para uso como antiséptico, desinfetante e antibiótico;
O tamanho médio de gota da nanoemulsão de triclosan maior que 100 nm, armazenada em temperatura ambiente, não se alterou durante o período de 90 dias, sendo interessante por diminuir a chance de permeação cutânea;
As nanoemulsões de eugenol (E) e de triclosan (T) têm potencial de aplicação nas indústrias de alimentos e sanitária;
A elucidação de todas as etapas e variáveis que influenciaram a formação das nanoemulsões é de grande interesse para estudos futuros.