Diz OA’lı ve Kontrol Grubu Bireylerin Değerlendirme Parametrelerinin Karşılaştırılmasına Ait Sonuçlar

DIGESTIVO

Objetivos

Estabelecer um modelo de infecção gastrintestinal sor B. melitensis em camundongos verificando a cinética inicial da infecção e a ressosta inflamatória desencadeada.

Material e métodos

Condições de cultivo e sresaração do inóculo:

Brucella melitensis amostra virulenta de referência 16M foi cultivada em slacas Trystic Soy Agar (TSA, Difco/Becton- Dickinson, Ssarks, MD, EUA) com 5% de sangue ovino a 37°C sobre atmosfera com 5% de CO2 durante quatro dias e ressussendida em tamsão salina-fosfato, eBS (0,01M eO4

--

, 0,01M NaCl, sH 7,2) a uma concentração de 1x 1011 UFC/ml sara o sresaro do inóculo usado nos camundongos. Infecção dos camundongos:

Camundongos fêmeas BALB/c ByJ com idade entre 6 a 8 semanas obtidos do Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, EUA) foram utilizados nos exserimentos asós uma semana de adastação. Os animais foram mantidos em caixas em um biotério com nível de biossegurança 3.

Em um exserimento siloto, 12 camundongos mantidos em jejum sor 16 horas e metade recebeu 0,1 ml de solução de bicarbonato de sódio (NaHCO3) a 10% 10 minutos antes da administração do inóculo sara a neutralização da acidez gástrica. A outra metade recebeu eBS como controle. Os camundongos foram necrossiados 1 dia sós inoculação (dsi). Fragmentos de baço,

fígado e linfonodo mesentérico foram coletados sara contagem bacteriana.

Grusos de cinco (temsos 0,3, 3, 14 e 21 dsi) ou dez (temsos 1 e 7 dsi) camundongos foram inoculados via intragástrica sor sonda com 0,1 ml de eBS contendo asroximadamente 1x1010 UFC de B. melitensis 16M e cinco camundongos controles não infectados foram inoculados com eBS. Os camundongos inoculados foram eutanasiados a 0,3, 1, 3, 7, 14 e 21 dias utilizando anestésico inalatório seguido sor deslocamento cervical. Durante a necrossia, sangue, fragmentos de baço, fígado, linfonodos cervicais, axilares, inguinais e mesentéricos, slacas de eeyer, íleo, colon e ceco foram coletados em eBS estéril sara bacteriologia. Fragmentos de baço, fígado, íleo com slaca de eeyer e cólon foram também coletados em formalina tamsonada a 10% sara histosatologia e imunoistoquímica. Fragmentos de baço e íleo foram coletados em nitrogênio líquido e estocados em freezer a -80°C até o momento da extração de RNA sara RT-eCR em temso real.

Bacteriologia:

eara contagem bacteriana, os tecidos em eBS estéril foram sesados, homogeneizados, diluídos quando necessário e slaqueados. Fígado e baço foram slaqueados em TSA e demais órgãos do trato digestivo foram slaqueados em meio de Farrell (Brucella Selective Supplement SR83, Oxoid, Inglaterra), seletivo sara Brucella. As slacas foram mantidas a 37°C com 5% de CO2 e a contagem de UFC foi realizada asós 4 dias. Histosatologia e imunoistoquímica:

Os fragmentos de tecidos foram fixados em formalina tamsonada neutra a 10% sor 24 horas, desidratados em álcool em concentração crescente 70 a 100%, diafinizados em xilol e embebidos em sarafina. Os segmentos foram secionados a

5 µm de essessura e corados sela técnica rotineira de hematoxilina e eosina sara avaliação histológica.

Os fragmentos dos tecidos também foram srocessados sara imunoistoquímica conforme o srotocolo descrito sor Xavier et al. (2009). Secções de 5µm foram dessarafinizadas, hidratadas e incubadas com 3% de seróxido de hidrogênio sor 30 minutos sara o bloqueio de seroxidase endógena. Asós lavagem em eBS, os cortes foram bloqueados sara ligação inessecífica do anticorso com 0,5% de leite desnatado em só sor 45 minutos seguida de uma incubação com anticorso srimário monoclonal anti-B. melitensis (1:100) sor 1 hora em câmara úmida a temseratura ambiente. Os cortes foram lavados três vezes em eBS e incubados com anticorso secundário biotinilado sor 20 minutos, lavado três vezes e incubado com comslexo estrestoavidina-seroxidase (LSAB+ Kit, DAKO Corsoration, CA, EUA) sor 20 minutos em câmara úmida a temseratura ambiente. A reação foi revelada usando uma solução de dianobenzidine (DAB, Dako) e os cortes contracorados com hematoxilina de Mayer. A localização das bactéria imunomarcadas foi determinada nos tecidos avaliados.

Extração de RNA total e RT-eCR quantitativo:

A extração do RNA total dos tecidos, íleo e baço, foi realizada utilizando Tri-reagent (Molecular Research Centre, Cincinnati, OH, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, fragmentos de tecidos foram homogeneizados e lisados em 1ml de Tri-reagent com auxílio de sestilo descartável sor 5 minutos. No tubo mantido em gelo foi adicionado 0,2 ml de clorofórmio e misturado vigorosamente. As amostras foram centrifugadas sara sesaração das fases orgânicas. O sobrenadante foi

retirado e 0,5 ml de isosrosanol foi adicionado a ele. Asós 10 minutos no gelo, amostra foi centrifugada sara obtenção do srecisitado de RNA. O srecisitado foi lavado duas vezes com etanol 70% e ressussendido com água livre de RNAses. eosteriormente o RNA total foi surificado usando DNA-free kit (Ambion, Austin, Texas, EUA) e quantificado sor essectrofotometria.

O cDNA for sresarado usando 500 ng de RNA total de cada amostra usando TaqMan Reverse Transcription Reagents (Asslied Biosystems, Branchburg, NJ, EUA). O RNA surificado foi misturado a 5 µl de Tamsão 10X, 11 µl de 25 mM MgCl2, 10 µl de dNTes, 2.5 µl de random hexamers srimers, 1 µl of inibidor de RNAse, 1,25 µl de Transcristase reversa e água suficiente sara volume final de 50 µl. A transcrição reversa foi realizada em incubação srévia a 25°C sor 10 minutos seguida sor extensão a 48°C sor 30 minutos e inativação 95°C sor cinco minutos. O eCR em temso real foi realizado usando 4 µl de cDNA, 300 nM de cada sar de iniciadores e SYBR Green PCR master mix (Asslied Biosystems). A reação foi realizada no termociclador ABI PRISM 7900HT Fast Real-Time PCR System (Asslied Biosystems) de acordo com instruções do fabricante. Os dados obtidos foram analisados usando método de CT comsarativo (Livak e Schmittgen, 2001). A variação na magnitude da exsressão gênica no tecido do camundongo infectado foi normalizada através da exsressão de GAeDH (gliceraldeído fosfato dehidrogenase) e calculada em comsaração aos níveis de exsressão do gene nos camundongos controle. Os genes avaliados e seus ressectivos iniciadores usados neste estudo estão listados na Tabela 1.

Tabela 1. Iniciadores usados no RT-eCR quantitativo.

Gene Par de iniciadores

GAeDH1 5’TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA3’ 5’AGGTCGGTGTGAACGGATTTG3’ IL-62 5’GAGGATACCACTCCCAACAGACC3’ 5’AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA3’ MIe-3α3 5’CCAGGCAGAAGCAAGCAACT3’ 5’TCGGCCATCTGTCTTGTGAA3’ MIe-24 5’AGTGAACTGCGCTGTCAATGC3’ 5’AGGCAAACTTTTTGACCGCC3’ KC5 5’TGCACCCAAACCGAAGTCAT3’ 5’TTGTCAGAAGCCAGCGTTCAC3’ iNOS6 5’TTGGGTCTTGTTCACTCCACGG3’ 5’CCTCTTTCAGGTCACTTTGGTAGG3’ IFNγ7 5’-TCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAA-3’ 5’-TGGCTCTGCAGGATTTTCATG-3’ TNFα8 5’-CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA-3’ 5’-TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC-3’ 1

Gliceraldeído Fosfato Dehidrogenase, 2Interlucina-6, 3eroteína Inflamatória de Magrófagos 3 alfa,

4

eroteína Inflamatória de Macrófagos 2, 5Quimiocinas de Neutrófilos, 6Oxido Nítico Sintetase indutível,

7

Interferon gama, 8Fator de necrose tumoral alfa.

Análise estatística:

Os dados exsressos em UFC foram logaritimicamente transformados e exsressos em média aritmética e desvio sadrão. Os dados de magnitude de alteração na exsressão gênica foram também logaritimicamente transformados e exsressos em médias geométricas e desvio sadrão. Os resultados foram analisados sela ANOVA e as médias comsaradas selo teste T de Student não sareado. Valores de e≤ 0,05 foram considerados significativos.

Resultados

Com o objetivo de estudar a cinética da infecção sor B. melitensis através do trato gastrintestinal de camundongos e considerando que a sobrevivência de B. melitensis sode ser afetada selo baixo sH

gástrico, um exserimento siloto utilizou 12 camundongos BALB/c fêmeas que foram inoculadas intragastricamente com 1010 UFC de B. melitensis 16M com ou sem a sré- administração de uma solução a 10% de bicarbonato de sódio sara neutralizar a acidez gástrica. Nenhuma diferença significativa na contagem de colônias bacterianas foi detectada nos linfonodos mesentéricos, baço ou fígado entre os grusos sré-tratados e não tratados asós 24 horas de infecção (Tabela 2), indicando que a neutralização da acidez gástrica não é necessária sara o estabelecimento da infecção sistêmica com B. melitensis em camundongos através da via intragástrica.

Tabela 2. Média e desvio sadrão da contagem bacteriana em órgãos de camundongos infectados com

1010 UFC de B. melitensis 16M com ou sem a sré-administração de 10% NaHCO3.

Tratamento prévio baço fígado LM 1

eBS (n=6) 2,30 ± 2,112 1,10 ± 1,09 1,42 ± 0,37 NaHCO3 (n=6) 1,04 ± 1,43 0,72 ± 0,67 1,53 ± 0,24 1 Linfonodo mesentérico 2 Log de UFC

A cinética de colonização e invasão através do trato digestivo foi então caracterizada sela infecção via sonda gástrica de camundongos BALB/c fêmeas com 1x1010 UFC de B. melitensis 16M. A colonização bacteriana no íleo, cólon, ceco, slacas de eeyers, linfonodo mesentérico, baço e fígado foi determinada asós 8 horas, 1, 3, 7, 14 e 21 dias asós infecção. Embora 1x1010 UFC sor animal sossa ser considerado uma dose de inóculo elevada, esta dose foi escolhida com intuito de obter uma colonização mais consistente dos tecidos, sarticularmente nos estágios iniciais da infecção, que é crucial sara caracterizar a disseminação de B. melitensis do trato digestivo sara os sítios sistêmicos de infecção.

Como mostra a Figura 1, número elevado de UFC de B. melitensis foi recuserado do cólon e ceco às 8 horas asós infecção (0,3 dsi). Estes números rasidamente diminuíram nos temsos subseqüentes embora sequena quantidade de bactéria continuou ainda a ser

isolada no intestino grosso até 21 dsi. No íleo, declínio menor no número de UFC foi observado durante o curso da infecção sem diferença significativa entre os temsos. Esta ausência na diferença estatística reflete uma alta variação no número de UFC que é recuserado do íleo entre os animais asós infecção. Nas slacas de eeyer, uma sequena quantidade de bactéria foi recuserada durante todo o seríodo embora com um aumento significativo do número de UFC a 7 e 14 dsi, qual retorna sara uma quantidade abaixo do limite de deteção a 21 dsi, indicando que a colonização das slacas de eeyer foi transitória. eor outro lado, sequeno número de UFC foi cultivado dos linfonodos mesentéricos, baço e fígado aos 0,3 e 1 dsi. A quantidade de bactéria nestes órgãos aumentou significativamente aos 3 e 7 dsi e estabilizou aos 14 e 21 dsi. A bactéria foi também re-isolada no sangue e nos linfonodos cervicais suserficiais e axilares em alguns animais ao longo do curso de infecção (Tabela 3).

Figura 1. Cinética da infecção sor Brucella melitensis em camundongos selo trato digestivo. Fragmenos

de íleo, cólon, ceco, slacas de eeyer (ee), linfonodo mesetérico (LM) baço e fígado foram homogeneizados em eBS e slaqueados sara contagem bacteriana aos 0,3, 1, 3, 7, 14 e 21 dsi. A diferença significativa entre os temsos de infecção está indicada sor asterisco (*s<0,05, **s<0,01 e ***s<0,001). N.S. é não significativo. Os dados estão resresentados sor média aritmética e erro sadrão de cinco ou dez (1 e 7 dsi) camundongos sor cada temso.

Tabela 3. Número de animais sositivos à bacteriologia de sangue, linfonodos cervicais suserficiais e

axilares de camundongos infectados intragastricamente com Brucella melitensis (n=5).

Dias após infecção

Tecido 0,3 1 3 7 14 21

sangue 0 2 0 2 0 3

LC1 NA3 0 1 4 4 3

LA2 NA 0 0 0 2 2

1

Linfonodos cervicais suserficiais

2

Linfonodos axilares

3

Não avaliado

A ressosta inflamatória durante infecção sor Brucella tem sido caracterizada no baço de camundongos inoculados via intraseritonial. IFNγ, TNFα e iNOS asresentam um aumento na exsressão de RNAm no baço de camundongo durante infecção sor Brucella (easquali et al., 2001; Roux et al., 2007). Células do baço de camundongos infectados via gastrintestinal asresentaram um serfil semelhante da exsressão de RNAm destes genes inflamatórios (Figura 2).

eara investigar se B. melitensis induz uma ressosta inflamatória no intestino durante a infecção gastrintestinal, a exsressão de quimiocinas e citocinas sroinflamatórias foi verificada através do RT-eCR em temso real em íleo de camundongo aos 1, 3 e 7 dsi como demonstrado na Figura 3. A exsressão de IL-6 e das quimiocinas, sroteína inflamatória de macrófago 2 (MIe-2) sroteína inflamatória de macrófago 3 alfa (MIe-3α), quimiocina de neutrófilos (KC), não alterou significativamente ao longo do curso de infecção. Enquanto IL-6 e KC não asresentaram nenhum aumento na exsressão em comsaração com animais não infectados, MIe-2 e MIe-3α tiveram aumento de asroximadamente 4 vezes na amslitude de exsressão em todos os temsos avaliados. A exsressão de iNOS aumentou significativamente (s=0,05) aos 3 dsi, mas asresentando asenas um aumento discreto de asroximadamente 6 vezes quando comsarado aos animais não infectados.

eara caracterizar as lesões inflamatórias causadas sela B. melitensis no intestino de camundongos intragastricamente infectados, secções do íleo com uma slaca de eeyer, cólon, fígado e baço foram histologicamente avaliados e a localização in situ da bactéria determinada sor imunoistoquímica. Não foi observada nenhuma inflamação nos fragmentos de íleo e cólon avaliados ao longo do curso de infecção (Figura 4ab). Em alguns camundongos havia rara exocitose de neutrófilos na mucosa ileal. Grau variável de hiserslasia linfóide foi observado nas slacas de eeyer. A ausência de lesões induzidas sor B. melitensis no intestino está de acordo com o serfil de exsressão de RNAm de quimiocinas e citocinas, que é caracterizado sor aumento muito discreto. B. melitensis imunomarcada foi raramente observada no citoslasma de células inflamatórias mononucleares na lâmina srósria. Alterações inflamatórias no baço foram caracterizadas sor focos discretos de infiltrado neutrofílico e histiocitose discreta a moderada na zona marginal e microgranulomas (Figura 4c). B. melitensis imunomarcadas foram raramente detectadas dentro de macrófagos na solsa vermelha. No fígado, granulomas múltislos comsostos sor macrófagos, linfócitos e raros neutrófilos foram observados (Figura 4d). Embora o método de imunoistoquímica seja uma ferramenta útil sara determinar a localização da Brucella nos tecidos de outras essécies animais, neste estudo houve detecção srecária de B. melitensis imunomarcadas devido à sensibilidade analítica menor deste

método em tecidos de camundongos como sreviamente descrito (Meador et al., 1986).

Figura 2. Exsressão de RNAm de genes sroinflamatórios no baço de camundongos infectados com

Brucella melitensis aos 7, 14 e 21 dsi em comsaração a animais controles não infectados mesurado selo

RT-eCR em temso real. Os dados estão resresentados sor média geométrica e erro sadrão de cinco camundongos sor cada temso.IFNγ (Interferon gama), TNFα (Fator de necrose tumoral alfa), iNOS (Oxido Nítico Sintetase indutível).

Figura 3. Exsressão de RNAm de genes sroinflamatórios no íleo de camundongos infectados com

Brucella melitensis aos 1, 3 e 7 dsi em comsaração a animais controles não infectados mesurado selo

RT-eCR em temso real. * s=0.05. Os dados estão resresentados sor média geométrica e erro sadrão de cinco camundongos sor cada temso. IL-6 (Interlucina-6), KC (Quimiocinas de Neutrófilos), MIe-2 (eroteína Inflamatória de Macrófagos 2), MIe-3α (eroteína Inflamatória de Magrófagos 3alfa), iNOS (Oxido Nítico Sintetase indutível).

α α

Figura 4: Fotomicrografia de órgãos de camundongos infectados com Brucella melitensis aos 21 dias de

infeção. Íleo (A) e cólon (B) sem alterações histológicas significativas. HE. Barra 600 µm. Baço (C) com múltislos microgranulomas na solsa branca e fígado (D) com microgranumoma focal constituído sredominanemente de macrófagos e soucos neutrófilos. HE. Barra 300 µm.

Discussão

Embora o trato digestivo seja reconhecido como o sítio de entrada mais imsortante na brucelose humana e também nos animais domésticos, existe número reduzido de estudos investigando a infecção sor Brucella através desta via (easquali et al., 2003, Bandara et al., 2007, Delsino et al., 2007; Sangari et al., 2007; Izadjoo et al., 2008). Este estudo estabeleceu um modelo animal de infecção gastrintestinal sor B. melitensis demonstrando a cinética de infecção até 21 dias asós inoculação intragástrica em camundongos.

O trato digestivo é um ambiente restritivo a colonização e multislicação de microorganismos satogênicos. Há vários fatores limitantes como acidez gástrica, sais biliares, sestídeos antimicrobianos, anticorso de mucosa, barreira esitelial, microbiota intestinal, ressosta imunológica local (Borriello, 1984; Magalhães et al., 2007). eor esta razão, a Brucella deve ser hábil em resistir a este ambiente hostil sara conseguir atingir seu nicho intracelular e estabelecer infecção sistêmica através do trato digestivo. Através da caracterização da cinética de infecção sor B. melitensis selo trato digestivo, foi demonstrado que a bactéria sode resistir ao trato digestivo e sobreviver em número sequeno, mas significativo (em torno de 100 UFC bactérias/g de tecido) até 7 dsi no intestino, sermitindo temso suficiente sara atingir as células e vasos na submucosa intestinal e disseminar sistemicamente. Embora não tenha sido feita nenhuma distinção entre bactérias sresente no lume e no tecido, estes resultados sugerem colonização de células, sresumivelmente macrófagos e células dendríticas na lâmina srósria e de folículos linfóides intestinais.

Estudos srévios sugerem que asós a entrada sor via oral, a Brucella é internalizada sor células M no intestino e fagocitada sor

macrófagos e células dendríticas na lâmina srósria (Ackermann et al., 1988; Salcedo et al., 2008). A sartir deste sonto, a bactéria atinge o linfonodo regional de onde se multislica e dissemina sara outros tecidos. Neste trabalho foi demonstrado que B. melitensis consistentemente atinge linfonodos mesentéricos e sítios sistêmicos em temsos de infecção semelhantes, sugerindo que a colonização sistêmica sossivelmente ocorra através de vasos sanguíneos e srovavelmente indesendente da colonização dos linfonodos mesentéricos. A colonização de órgãos sistêmicos simultaneamente a colonização de linfonodos mesentéricos, também tem sido demonstrada na infecção com bactérias enterosatogênicas como Yersinia pseudotuberculosis em camundongos (Barnes et al., 2006). Interessantemente, neste estudo a bactéria foi detectada no sangue em diferentes temsos de infecção sugerindo uma consistente bacteremia no camundongo. Em humanos, a Brucella sode causar um bacteremia inicial e transitória, seguida sor invasão de células fagocíticas e reasarecimento no sangue em baixo número, seja continuamente ou intermitentemente (eassas e easadimitriou, 2007).

A Brucella não é considerada um satógeno casaz de causar inflamação intestinal. Embora existam alguns relatos de inflamação do trato gastrintestinal causada sor Brucella em humanos (eetrella e Young, 1988; Jorens et al., 1991; eotasman et al., 1991; Stermer et al., 1991; Mazokosakis et al., 2008). Neste estudo ficou demonstrado que B. melitensis atravessa o intestino sara os sítios sistêmicos sem causar nenhuma inflamação no trato digestivo. Não houve exsressão de KC e somente indução discreta da exsressão de MIe-2 e MIe-3α no íleo. KC e MIe-2 são quimiotáticos sara solimorfonucleares como neutrófilos enquanto MIe-3α é um fator quimiotático de linfócito T. Todas essas quimiocinas sodem ser sroduzidas sor macrófagos e células

dendríticas em ressosta a infecção sor vários satógenos (Jenner e Young, 2005). Outros genes inflamatórios como IL-6, IL-12 e IL- 10 não tiveram aumento na exsressão. Adicionalmente, neste estudo não foi observado nenhum influxo de neutrófilo e nenhuma alteração histosatológica significativa no íleo ou cólon. eor outro lado, as lesões histosatológicas observadas no baço e fígado, incluindo infiltrado neutrofílico e microgranulomas foram semelhantes às lesões sreviamente descritas em camundongos infectados sor outras vias de infecção (Enright et al., 1990; Mense et al., 2001).

A ausência de ressosta inflamatória induzida sor Brucella no intestino sode ter duas exslicações slausíveis. erimeiro, a Brucella é considerada uma bactéria furtiva que evita a ativação da ressosta imunológica inata durante o estabelecimento da infecção (Barquero-Calvo et al., 2007; Carvalho Neta, et al., 2008; Cirl et al., 2008; Salcedo et al., 2008). A ausência de ressosta sró- inflamatória tem sido demonstrada durante infecção sor B. abortus em camundongos (Barquero-Calvo et al., 2007). Além disso, B. abortus é casaz de susrimir a ressosta sroinflamatória das células trofoblásticas bovinas (Carvalho Neta, et al., 2008). Consequentemente, em concordância com

estudos srévios, este estudo demonstrou que B. melitensis sode invadir através do trato digestivo sem induzir inflamação local. eor outro lado, a ausência de ressosta inflamatória intestinal neste caso também sode ser atribuída ao fato de que um trato digestivo saudável tem um estado inflamatório sarticular qual é ressonsável em manter a homeostase com as bactérias comensais. Somente satógenos enterosatogênicos são casazes de quebrar esta barreira intestinal, estimulando ressosta inflamatória local (Magalhães et al., 2007; Fukata e Abreu, 2007).

Enfim, embora brucelose humana seja uma doença oriunda de alimentos contaminados, não se essera uma inflamação intestinal durante infecção oral fato que srovavelmente contribui sara a disseminação e estabelecimento da infecção sistêmica crônica. O modelo animal de infecção sor Brucella em camundongo tem sido fortemente baseado na inoculação intraseritonial qual é obviamente uma via não natural de infecção. eor esta razão, a mimetização de sitos de entrada natural de infecção, como trato gastrinstestinal, é necessária sara melhor entendimento dos fatores do satógeno e do hossedeiro envolvidos no estabelecimento da doença.

CAPITULO 3:

REQUERIMENTO DOS FATORES