Diferansiyel Boyama ile Hücre Sayılarına Ait Sonuçlar

O primeiro teste desenvolvido para avaliação da integridade da membrana plasmática foi o supravital, também conhecido como teste dos vivos ou mortos. Esse teste, assim como os demais testes de integridade de membrana, se baseia no fato de que a membrana plasmática íntegra poderia prevenir a entrada do corante no citoplasma celular. A combinação da eosina- nigrosina é a mais utilizada, pois a eosina penetra pela membrana lesionada dos espermatozoides, corando o interior do núcleo e possibilitanto identificar os espermatozoides mortos. É uma técnica de fácil uso e que dispensa o uso de microscópio especial.

Melo & Henry (1999) evidenciaram valores entre 73% e 82,6% de espermatozoides não-corados (vivos) após a realização da técnica de eosina- nigrosina em sêmen equino resfriado com diferentes diluidores. Além disso, verificaram alto índice de correlação (r=0,75; P<0,05) entre a taxa de espermatozoides não-corados e a motilidade total e progressiva. Johansson et al. (2008) observaram correlações positivas (P<0,01) entre o supravital (eosina- nigrosina) e a motilidade espermática e morfologia do sêmen de garanhões, r=0,72 e 0,57, respectivamente.

Nunes et al. (2008) evidenciaram 79 a 90% de espermatozoides viáveis pela coloração de eosina-nigrosina após resfriamento por 24 horas e 72 a 87% de espermatozoides viáveis após 48 horas.

2.4.3. Teste hiposmótico

O teste hiposmótico (HOST) é relativamente simples para avaliação da integridade funcional da membrana espermática. A membrana plasmática bioquimicamente ativa é requerida para que ocorram os processos de capacitação e reação do acrossoma e de ligação da célula espermática à superfície do oócito. Esse teste foi desenvolvido inicialmente para o sêmen

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humano (Jeyendran et al., 1984) recentemente vem sendo usado em bovinos (Correa & Zavos, 1994; Correa et al., 1997), suínos (Vazquez et al., 1997), cães (Kumi-Diaka, 1993) e garanhões (Neild et al., 1999; Melo & Henry, 1999; Lagares et al., 2002; Fürst, 2006).

Durante o teste hiposmótico, a atividade bioquímica do espermatozoide promove o influxo de água, em decorrência da maior osmolaridade presente no interior da célula espermática, desencadeando o aumento do volume interno para o equilíbrio entre o compartimento fluido no interior do espermatozoide e o compartimento extracelular. Esse aumento no volume é associado à expansão da membrana celular que recobre a cauda, provocando seu enrolamento em situações em que o espermatozoide possui a membrana funcionalmente intacta (Figura 2). O enrolamento inicia-se na extremidade da parte distal da cauda e prossegue para a peça intermediária e a cabeça, onde a pressão osmótica é reduzida (Drevius & Eriksson, 1966; Jeyendran et al., 1984).

Pommer et al. (2002) avaliaram a resistência da célula espermática equina em diversas pressões osmóticas e observaram que osmolaridades inferiores a 150 e superiores a 900 mOsm/L podem ser prejudiciais à motilidade e à integridade da membrana plasmática.

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Figura 2 - Tipos de enrolamento de cauda de espermatozoides equinos considerados bioquimicamente funcionais (Neild et al., 2000).

O meio hiposmótico deve possuir uma pressão ótima que cause aumento suficiente do volume celular, mas que não seja inferior à osmolaridade para promover a lise da membrana celular. Os meios hiposmóticos contêm geralmente frutose e citrato de sódio misturados em iguais proporções (Jeyendran et al., 1984; Kumi-Diaka, 1993; Correa & Zavos, 1994; Correa et al., 1997), ou frutose, citrato de sódio, lactose e sacarose sozinhos (Neild et al., 1999). Os melhores resultados são obtidos em osmolaridades de 50 a 150 mOsm/L (Jeyendran et al., 1984; Amirat et al., 2004). Os resultados do teste hiposmótico têm boa correlação com a motilidade espermática progressiva (Jeyendran et al., 1984; Kumi-Diaka, 1993; Correa & Zavos, 1994; Neild et al., 1999; Juhazs et al., 2000).

Melo & Henry (1999), avaliando duas soluções de açúcares (frutose e sacarose), duas de eletrólitos (citrato de sódio e cloreto de sódio) e diversas osmolaridades (50, 100, 150, 200, 250 e 300) no teste hiposmótico para equinos, concluíram que a solução mais indicada para esse teste na espécie equina é aquela à base de sacarose a 100 mOsm/L.

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Lagares et al. (2002) estudaram diversas osmolaridades das soluções hiposmóticas pelo volume celular no espermatócrito e, avaliando a integridade da membrana pela coloração de eosina-nigrosina, observaram correlação positiva entre o volume celular no espermatócrito e das células viáveis. Jannet et al. (2003a) evidenciaram correlação negativa (r= -0,4) entre o enrolamento da causa no teste hiposmótico e o número de serviços por gestação em pesquisa na qual utilizaram uma solução de 100 mOsm/L e sêmen congelado de garanhões. Neild et al. (2000) avaliaram a utilização de solução de lactose (50 mOsm/L) do sêmen fresco de 25 garanhões e observaram 56,1% ± 14,2 de reatividade ao teste hiposmótico. Esses autores verificaram também correlação de r=0,82 (p=0,0001) com a motilidade progressiva, de r=0,53 (P=0,008) com a porcentagem de espermatozoides morfologicamente normais e de r=0,08 (P=0,75) apenas com a taxa de gestação. Neste estudo, o sêmende 6 dos 25 animais utilizados apresentou 20-40% de motilidade espermática progressiva, porém com 50-60% de reatividade ao teste hiposmótico e mais de 80% de fertilidade.

2.4.5. Corantes (sondas) fluorescentes

As estruturas e funções espermáticas que podem ser avaliadas com corantes fluorescentes incluem integridade e viabilidade da membrana plasmática, integridade acrossomal, respiração mitocondrial e integridade do DNA (Graham et al., 1990; Garner & Johnson, 1995).

A determinação da integridade da membrana plasmática pode ser realizada por meio da utilização de corantes fluorescentes impermeáveis à membrana e que possuem afinidade ao DNA. Desse modo, as células não- coradas são consideradas membranas plasmáticas intactas. O iodeto de propídio (PI), Hoeschst 33258 (H258), YoPro-1, brometo de etídio, homodímero de etidio-1 (EthD-1), ToPro-1 e TOTO são os exemplos mais comuns dessas sondas. Uma alternativa é o uso de sondas acetiladas, que contêm radicais acetil, passam pela membrana intacta, e imediatamente são desacetiladas por esterases intracelulares, tornando-se impermeáveis e permitindo a emissão de luz verde no microscópio de epifluorescência. Assim, as células intactas apresentam coloração, porém é possível haver ligação das sondas às células

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deterioradas com membrana lesada. Exemplos dessas sondas são o diacetato de carboxifluoresceína (CFDA), diacetato de carboxidimetilfluoresceína (CDMFDA) e SYBR-14, que coram as células íntegras de verde. O mais rotineiramente utilizado é a combinação desses dois tipos de sondas, como SYBR-14 ou CFDA com PI ou EthD-1, que permite detectar as células com a membrana plasmática intacta e lesada (Figura 3), respectivamente (Aurich, 2005; Turner, 2005).

Figura 3 - Espermatozoides íntegros (verde) e lesados (vermelho) pela coloração de fluorescência SYBR-14/PI (Turner, 2005).

O iodeto de propídio possui algumas vantagens, como facilidade de preparação e aplicação e estabilidade e eficiência na avaliação da integridade da membrana corada. Além disso, é melhor que o brometo de etídio, por ser menos lipofílico e menos permeante à membrana plasmática (Jeulin et al., 1982). Assim, é bastante utilizado, tanto isoladamente como em associações a outros corantes. Esse tipo de sonda possui afinidade pelo DNA e cora em vermelho o núcleo de células com a membrana plasmática lesada (Graham et al., 1990; Arruda, 2000).

As sondas fluorescentes podem ser utilizadas na citometria de fluxo e possibilitam avaliar facilmente informações de subpopulações em uma amostra, o que é ideal para a análise de populações heterogêneas, como os espermatozoides (Gillan et al., 2005). A análise pelo citômetro de fluxo é objetiva e permite a leitura de dezenas de milhares de células espermáticas em aproximadamente um minuto e, ainda, a associação de sondas fluorescentes (Graham, 2001).

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Love et al. (2003) utilizaram o iodeto de propídio e o SYBR-14 em associação com o JC-1 (avalia funcionalidade mitocondrial) para avaliação da integridade de membrana do sêmen de garanhões diluídos com o EZ-Mixin® e resfriados no Equitainer® por 24 horas. Esses autores adicionaram diversas proporções de espermatozoides mortos para avaliação e comprovação dessas duas técnicas e verificaram alta correlação (r=0,98; P<0,0001) entre a motilidade total avaliada pelo sistema CASA e a integridade de membrana avaliada por auxílio da citometria de fluxo. Kuisma et al. (2006) também verificaram correlação significativa entre a técnica do CFDA/PI e a de motilidade progressiva. Pagl et al. (2006) verificaram a utilização de diferentes diluidores compostos à base de leite ou frações de leite e observaram, pela coloração de fluorescência SYBR-14 e iodeto de propídio, variação de 64-90% e espermatozoides íntegros após o resfriamento do sêmen com esses diluidores a 5 oC por 24 a 72 horas. Kareskoski et al. (2006) utilizaram a associação do CFDA com o iodeto de propídio para avaliar sêmen equino diluído com o meio extensor de Kenney resfriado no Equitainer® por 24 horas e observaram que a porcentagem de espermatozoides considerados íntegros variou de 50-65% e de 20-35% no caso do sêmen congelado pela mesma técnica de fluorescência.

2.4.5. Teste de termorresistência (TTR)

O teste de termorresistência foi inicialmente proposto em 1967 por Dimitropoulos para avaliação do potencial de fertilidade do sêmen bovino congelado e posteriormente foi adaptado para as demais espécies. O teste se baseia na incubação de uma amostra de sêmen em banho-maria, em temperatura e tempo pré-determinados de acordo com a espécie animal. A temperatura e o tempo variam de acordo com o tipo de TTR realizado: no TTR lento a temperatura situa-se em torno de 37oC, enquanto no TTR rápido

a temperatura é mais elevada (45oC). A motilidade e o vigor são as

características normalmente avaliadas durante o TTR e que podem ser avaliadas para o sêmen equino a intervalos de 20, 30 ou 60 minutos até o final do TTR, que pode chegar até 240 minutos (CBRA, 1998; Zúccari, 1998). O teste de termorresistência possui grande aceitação entre os testes na

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espécie bovina, principalmente por sua alta relação (0,78) com a fertilidade a campo (Dimitropoulos, 1967).