Diferansiyel Boyama ile Hücre Sayılarına Ait Sonuçlar

Differansiyel floresan boyama (Şekil 4.3) sonucunda kontrol, SSV ve SSV+10 ̄ ¹² M melatonin gruplarında ortalama hücre sayıları sırasıyla; 64±2,97, 48,33±2,33 ve 64±2,07 olarak hesaplanmıştır. İç hücre kitlesi sayısı, trofektorderm hücre sayıları ve toplam hücre sayıları bakımından kontrol grubu ile SSV+ 10 ̄ ¹² M grubu arasında anlamlı bir fark tespit edilmez iken SSV grubunda tüm değerler kontrol ve SSV+ 10 ̄ ¹² M grubundan düşük bulunmuş ve aradaki farkın istatistiksel olarak önemli olduğu tespit edilmiştir. Sonuçlar Çizelge 4.2’de verilmiştir.

Çizelge 4.2.Diferansiyel floresan boyama ile blastosistlerde hücre sayılarının belirlenmesi

Grup İç hücre kitlesi sayısı

Trofektorderm

hücre sayıları Toplam hücre sayıları

Kontrol 18,67±0,82a 45,33±4,76a 64±2,97a

SSV 13,33±1,08b 35±2,55b 48,33±2,33b

SSV+Melatonin 17,33±0,82a _46,67±1,36a _64±2,07a

42 Şekil 4.1. Embriyo 8 hücreli fotoğrafı

Şekil 4.2. Blastosist evresindeki embriyo fotoğrafı

Şekil 4.3. de gösterildiği gibi differansiyel florasan boyama yöntemi ile blastosistler boyanmış; mavi florasan ile iç hücre kitlesi (ICM), kırmızı florasan ile trofektoderm hücreleri sayılmış ve blastosist oluşumunda ortaya çıkan toplam hücre sayıları saptanmıştır (Çizelge 4.2).

43

Şekil 4.3. Differansiyel floresan boyama ile blastosist görüntülemesi

44 5.TARTIŞMA VE SONUÇ

Embriyo dondurma teknolojisi, deney hayvanları ve çiftlik hayvanlarına ait değerli genetik kaynakların uzun süreli korunmasını sağlamak amacı ile kullanılan önemli ve gerekli bir teknolojidir. Bununla birlikte, oositler ve erken embriyolar dondurarak saklamaya karşı çok hassastır ve son birkaç yılda yeni ilerlemeler kaydedilmesine rağmen mükemmel bir protokol henüz kurulmamıştır. Tüm oositler ve embriyolar, kriyoprezervasyon sırasında önemli morfolojik ve fonksiyonel hasara uğrarlar, ancak sağkalım ve gelişim oranlarındaki farklılıkların yanı sıra hasar görme derecesi, türlere, gelişim aşamasına ve kökene (örneğin, in vitro üretilen veya in vivo) bağlı olarak oldukça değişkenlik gösterir. Meydana genel hasarlar in vitro gelişimde ve sonrasında da implantasyonda sorunlar yaratabilmektedir. Bu problemi çözümü için hala çalışmalar devam etmekte, farklı dondurma teknikleri, farklı kriyoprotektan konsantrasyonları ve kombinasyonları, kriyoprotektana destek ilave katkılar kullanılması dışında embriyo çözündürme sonrası kültür medyumları geliştirilmesi amacıyla farklı ROS, apoptoz ve hücre içi hasar önleyici antioksidanların kullanımı üzerinde durulmaktadır. Günümüzde gamet ve embriyoların dondurarak saklanması için yavaş donma ve vitrifikasyon olmak üzere temelde iki yöntem vardır.

Vitrifikasyon, özellikle in vitro üretilen veya mikro manipule edilmiş embriyolar ve oositlerle çalışırken, geleneksel yaklaşımlara kıyasla daha uygulanabilir ve umut verici bir alternatif haline gelmiştir (Bagis ve ark. 2002, Pereira ve Marques 2008). Bu tez çalışmasının da amacı SSV vitrifikasyon tekniği ile dondurulan fare embriyolarının in vitro kültürüne melatonin ilavesinin embriyonun gelişimine etkisini incelemektir.

Erken dönem embriyolarda yavaş dondurmaya göre daha başarılı olan vitrifikasyon ile dondurma için bugüne kadar çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bunların çoğunda embriyonun içinde bulunduğu solusyonu taşıyan cam veya plastik malzemeler kullanılmakta ve bu maddelerde donma hızını kısmen de olsa olumsuz etkileyebilmektedir. Vitrifikasyon yöntemlerinden biri olan SSV yönteminde diğerlerinden farklı olarak sadece vitrifiye edilecek oosit veya embriyoların içinde bulunduğu çok küçük kristal damla dondurulmaktadır. Bu damla hiçbir ekstra malzemenin içinde değildir ve soğukla direk temas halindedir. Bu yöntem ilk defa

45

çözüldükten sonra gen transferi yapılarak transgenik fare elde etmek için tek hücreli fare embriyolarının dondurulmasında başarı ile uygulanmıştır (Bagis ve ark. 2002). Daha sonrasında da değişik çalışmalarda yavaş dondurma ve diğer vitrifikasyon yöntemleriyle kıyaslanmış ve daha iyi sonuçlar alındığı gösterilmiştir (Bagis ve ark.2004b, Bagis ve ark.2005, Bagis ve ark. 2010). Kaynaklar incelendiğinde SSV vitrifikasyon tekniği kullanılarak immatur oosit (Peng ve ark. 2007, Pan ve ark. 2018), pronuklear embriyo (Bagis ve ark. 2002, 2004b, 2005, 2009, 2010), sekiz hücreli (Boonkusol ve ark. 2006), morula ve blastosit (Baranyai ve ark. 2005) aşamasında fare embriyolarının dondurulduğu görülmektedir. Bu tez çalışmasında daha önce başarıyla uygulandığı belirtilen SSV vitrifikasyon tekniği kullanılmış ancak ilk defa kültür medyumuna melatonin ilavesinin bu yöntem ile vitrifiye edilen fare embriyolarının çözüm sonrası gelişimine etkisi araştırılmıştır.

Ghandy ve Malekshah (2017) vitrifikasyonun (cryotop) hangi embriyonik dönemde daha başarılı uygulanacağını araştırdıkları bir çalışmada 2 hücreli, 4 hücreli, 8 hücreli, morula ve blastosist dönemindeki embriyoları kullanmışlar, erime sonrası blastosist gelişimini incelemişlerdir. Bu çalışma sonucunda araştırıcılar vitrifikasyonun, fare embriyonik gelişiminin tüm aşamalarında kriyo konservasyon için uygun olduğunu, bununla birlikte çözüm sonrası en iyi sonuçların 4 ve 8 hücreli gelişim aşamalarında vitrifiye edilen embriyolarda gözlendiğini bildirmişlerdir. Bu tez çalışmasında da benzer şekilde in vitro geliştirilen 8 hücreli embriyolar kullanılmış ancak farklı bir vitrifikasyon (SSV) yöntemi uygulanmıştır.

İn vivo koşullar altında, foliküler sıvılarda bulunan bazı serbest radikal toplayıcı antioksidanlar oositleri oksidatif strese karşı koruyabilmelerine (Wang ve ark. 2002) karşın bu antioksidatif ortam in vitro kültür koşullarında daha zayıf (Nagina ve ark. 2016) olduğundan oositler veya embriyolar ciddi oksidatif strese maruz kalmaktadırlar. Bu nedenle tek başına embriyo kültürü bile embriyonal gelişim üzerinde olumsuz etkiler yaratabilmekte ve bu nedenle her zaman in vitro üretilen embriyolar, in vivo gelişen embriyolar ile karşılaştırıldığında, daha dayanıksız olmaktadır. Bu nedenle in vitro embriyo kültür ortamının geliştirilmesi için çeşitli takviyeler üzerinde araştırmalar hala devam etmektedir. Bu sorunun üstesinden gelmenin en etkili yolu, kültür ortamını antioksidan ajanlarla desteklemektir. Diğer serbest radikal süpürücülere kıyasla, melatonin suda ve lipidlerde çözünürlüğü nedeniyle en çok tercih edilen ajan olarak kabul edilir (Hardeland 2005, Do ve ark. 2015). Embriyo kültür ortamındaki

46

melatoninin takviyesinin sıçan, fare ve tavşan embriyo gelişimini ve implantasyonunu arttırdığını gösteren çeşitli çalışmalar mevcuttur (Ishizuka ve ark. 2000, Smith ve ark. 2003, Salmen ve ark. 2005, Adlam ve ark. 2005, Dair ve ark. 2008, Pallab ve ark. 2009, Tian ve ark. 2010, Asgari ve ark. 2012, Bahadori ve ark. 2013, Wang ark. 2013, Gao ve ark. 2013, Salehi ve ark. 2014, Mehaisen ve Saeed 2015). Bu çalışmalardan birinde melatoninin hem in vitro fertilizasyon hem de embriyonik gelişme üzerindeki etkisini incelemek için, in vitro fertilizasyondan sonra fare embriyoları 10 ̄ ⁸M, 10 ̄ ⁶ M ve 10 ̄ ⁴ M konsantrasyonlarda melatonin içeren veya içermeyen bir ortamda kültüre edilmiş, melatoninin, in vitro fertilizasyon oranını ve sonrasında da erken embriyo gelişimini desteklediği gösterilmiştir (Ishizuka ve ark. 2000).

Benzer şekilde melatoninin embriyo kültür medyumuna ilavesinin, koyun (Abecia ve ark. 2002, Va´zquez ve ark. 2010, Succu ve ark. 2014), keçi (Saeedabadi ve ark. 2018),manda (Manjunatha ve ark. 2009, El-Sokaryve ark. 2017), sığır (Yoshioka ve ark. 1997, Gutierrez ve ark. 2001, Tian ve ark. 2014, Wang ve ark. 2014, Zhao ve ark. 2016, El-Raey ve ark. 2011b, Rodrigues-Cunha ve ark. 2016, Lin ve ark. 2017), ve domuz (Rodriguez-Osorio ve ark. 2007, Choi ve ark. 2008, Kang ve ark. 2009, Shi ve ark. 2009, El-Raey ve ark. 2011a, Nakano ve ark. 2012, Zhao ve ark. 2015, Do ve ark. 2015, Li ve ark. 2015, Li ve ark. 2016, Chen ve ark. 2017) gibi çiftlik hayvanlarının oosit olgunlaşması ve embriyo gelişimi üzerine yararlı etkilerini gösteren birçok çalışma sonuçları rapor edilmiştir.

ROS, hidrojen peroksit (H₂O₂), süperoksit anyonlar ve hidroksil radikal üretimindeki artış kriyoprezervasyon sırasında oluşan apoptoz veya nekroz tetikleyiciler olarak sıralanabilir (Mazilli ve ark. 1995, Sohn ve ark. 2002, Cabrita ve ark. 2005). İn vitro gelişimi olumsuz olarak etkileyen faktörlerden biri kriyopreservasyon sonrası ROS seviyesindeki artışın, hücre içi oksidatif sistemleri etkilemesidir (de Leon ve ark. 2012, Zhang ve ark 2016, Tsang ve Chow 2010, Marquez ve ark. 2004, Jurisicova ve ark. 1996, Yang ve ark. 1998, Thomson ve ark. 2009). Oksidatif stres, vitrifikasyon işlemi sırasında hayvansal hücre ve dokuların ölümünde kritik bir faktördür. Spermatogonial kök hücreler ve testis dokuları vitrifikasyon işlemi sırasında çoklu strese maruz kalmaktadır (Gholami ve ark. 2013a, 2013b). Bu durum embriyolar içinde geçerlidir ve dondurulmuş embriyolar bu süreçte dondurmanın zararlı etkilerinden antioksidanlarla kısmen korunabilir (Hemadi ve ark. 2009, Nedambale ve ark. 2006, Hosseini ve ark. 2009). Melatoninin etkili antioksidanlar arasında yer aldığı savunulmaktadır (Zhao ve ark. 2016). Melatonin ve metabolitleri, antioksidan, antiapoptoz

47

özellikli güçlü serbest radikal önleyicisi olarak gösterilmesinden ötürü (Tamura ve ark. 2008, Yoo ve ark. 2011) çeşitli hayvan türlerinde vitrifikasyon sonrası embriyonik gelişimi desteklemek amacıyla birçok çalışmada kullanılmıştır.

Baranyai ve ark. (2005), in vivo gelişen sekiz hücreli embriyoları SSV tekniği ile dondurmuşlar ve çözüm sonrası in vitro blastosit gelişim oranlarını kontrol grubunda %100 ve SSV grubunda ise %95 olarak tespit etmişlerdir. Benzer şekilde Boonkusol ve ark. (2006) in vivo gelişen sekiz hücreli embriyolarda SSV vitrifikasyonu uygulamışlar ve embriyoların çözüm sonrası in vitro gelişim oranını %94 olarak bulmuşlardır. Bu tez çalışmasında in vitro gelişen sekiz hücreli embriyolar SSV yöntemi ile vitfiriye edilmiş ve çözüm sonrası blastosist gelişim oranı kontrol grubunda %97,14, SSV grubunda %86,49 ve SSV+ 10 ̄ ¹² M melatonin grubunda %92,86 olarak bulunmuştur. In vivo gelişen embriyoların kriyotoleransı in vitro embriyolardan daha yüksek olmasına karşın bu tez çalışmasında vitrifiye edilen in vitro embriyoların çözüm sonrası melatonin ile kültüre edildiğinde in vivo embriyolarla yapılan önceki çalışmalara yakın bir gelişim gösterdiği görülmektedir.

Çeşitli çalışmalarda vitrifikasyon ile dondurulmuş embriyoların çözüm sonrası kültür ortamlarına 10 ̄ 3_{, 10 ̄} 5_{, 10} -7_{, 10 ̄} 9_{, 10 ̄} 11_{M (Gao ve ark. 2012), 10 ̄} 6_{, 10 ̄} 9_{, 10 ̄} 12 _{M (Dehghani-} Mohammadabadi ve ark. 2014), 10 ̄ 6_{, 10 ̄} 9 _{M (Zhang ve ark. (2016) melatonin ilavelerinin} etkisi araştırılmıştır. Gao ve ark. (2012) yaptıkları çalışmada 2-hücreli fare embriyolarını açık uçlu pipet (OPS) yöntemi ile vitrifiye etmişler, çözüm sonrasında da farklı konsantrasyonlarda melatonin ( 10-3, 10 -5, 10 -7 , 10 -9 ve 10 -11 M) içeren M16 kültür medyumunda kültüre etmişlerdir. Araştırıcılar sonuç olarak 10 -11 _{M, 10} -9 _{M, 10} -7 _{ve 10} -5 _{M melatonin ile muamele} edilmiş vitrifiye 2 hücreli embriyoların blastosist oranını sırasıyla % 71.3 ± 7.45,% 76.8 ± 8.56,% 79.8 ± 8.72 ve% 71.3 ± 7.28 olarak saptamışlar ve bu oranların melatonin ile muamele edilmemiş vitrifiye 2 hücreli embriyonun blastosist oranından (%59.6) anlamlı derecede yüksek olduğunu belirlemişlerdir (P <0.05). Bu tez çalışmasında da 10 ̄ 12 _{M melatonin konsantrasyonu} kullanılmış benzer şekilde melatoninin dondurup çözülen embriyoların gelişme oranını desteklediği sonucuna varılmıştır.

Dehghani-Mohammadabadi ve ark. (2014) tarafından yapılan çalışmada NMRI fare ırk farelerde iki hücreli aşamada kriyotop tekniği ile vitrifiye edilen embriyolar çözüm sonrası 10 ̄ 6_{, 10 ̄} 9_{, 10 ̄} 12 _{M melatonin içeren KSOM embriyo kültür medyumlarında kültüre edilmiş ve in} vitro gelişim oranları araştırılmıştır. Bu araştırma sonucunda, 10 ̄ 12 M melatonin ilaveli kültür

48

medyumu grubunda blastosist gelişim oranı diğer gruplara gore anlamlı oranda yüksek bulunmuştur. Ayrıca trofektoderm ve iç hücre kitlesi hücre sayısının10 ̄ 9 _{M ve 10 ̄} 12 _M melatonin gruplarında anlamlı oranda artığı rapor edilmiştir. Yapılan tez çalışmasında ise 10 ̄ 12 _{M melatonin uygulanan SSV grubunda benzer şekilde blastosist gelişim oranı kontrol} grubunun gelişim oranına benzer ancak melatonin uygulanmayan SSV grubuna göre anlamlı olarak yüksek bulunmuştur. Ayrıca embriyo hücre sayılarının da melatonin uygulanan grupta uygulanmayandan yüksek ve kontrol grubuna benzer olduğu tespit edilmiştir (P<0.05).

Zhang ve ark. (2016) tarafından yapılan araştırmada, Kun Ming ırk farelerin metafaz II aşamasındaki oositleri OPS vitrifikasyon yöntemi ile dondurulmuş, çözüm sonrası, kimyasal aktivasyon uygulanan oositler parthenogenetik gelişim için 10 ̄ 6, 10 ̄ 9 M melatonin içeren KSOM medyumunda kültürü edilmiştir. Araştırma sonucunda 10 ̄ 9 M melatoninin parthenogenetik blastosist gelişimini desteklediği sonucuna varılmıştır.

Mehaisen ve ark. (2015)’nın çalışmasında tavşan morula aşamasında embriyolara vitrifikasyon uygulanmış ve çözündürme sonrası embriyo kültür medyumuna melatonin (10-3 M) ilave edilmiştir. İn vitro kültür sonunda melatonin uygulanmayan ve uygulanan vitrifikasyon grupları karşılaştırılmış, blastosist gelişim oranı melatonin grubunda (%81), melatonin uygulanmayan grupta (%69) olarak tespit edilmiştir. Bu tez çalışmasında da melatonin vitrifikasyon grubu melatonin uygulanmayandan daha yüksek blastosist gelişimi ile sonuçlanmıştır.

Succu ve ark. (2014), koyun embriyolarında vitrifikasyon sonrası kullanılan melatonin (10-9 M) ilaveli embriyo kültür medyumunun embriyo gelişimini desteklediğini tespit etmişlerdir. Manjunatha ve ark (2009) manda oositleri üzerinde yaptıkları bir çalışmada; farklı konsantrasyonlarda taurin ve melatonin (kontrol; kontrol + 0.5 mM taurin; kontrol + 1 mM taurin; kontrol + 3 mM taurin; kontrol + 5 µM melatonin; kontrol + 10 µM melatonin ve kontrol + 50 µM melatonin) içeren kültür ortamının in vitro oosit olgunlaşması ve embriyo gelişimi üzerine etkisini değerlendirmişlerdir. Araştırıcılar kültür ortamının taurin ve melatonin ile zenginleştirilmesinin, in vitro embriyo üretim verimliliğini artırdığını, özellikle kültür ortamına 10 µM melatonin ilavesinin çalışmamıza benzer şekilde TE sayısını artırdığını tespit etmişlerdir.

49

Son yıllarda serbest bir radikal olan melatonin, üreme ile ilişkili dokuların oksidatif stresine karşı korunma amacıyla kullanılmaktadır. Memelilere ait gamet ve embriyolarda yüksek lipid konsantrasyonu nedeniyle, oksidatif strese karşı oldukça hassas olduğu düşünülmektedir. Gametlerin dondurularak korunması, hayvancılık endüstrisi için ilerlemesi ve nesli tükenmekte olan türlerin korunmasına katkıda bulunmasına rağmen, gamet içi plazma memranında morfolojik hasara uğramaktadır (Succu ve ark. 2014).

Sonuç olarak; fare embriyoları ile yapılan daha önceki çalışmalarda vitrifikasyon yöntemi olarak OPS tekniği (Gao ve ark. 2012, Zhang ve ark.2016) kriyotop tekniği (Dehghani- Mohammadabadi ve ark. 2014) kullanılmış ve kültür ortamına melatonin takviyesinin etkisi araştırılmıştır. Ancak şimdiye kadar SSV tekniği ile vitrifiye edilen fare embriyolarının gelişimi üzerinde melatonin katkısının çalışıldığı başka bir araştırmaya rastlanmamış, ilk defa bu tez çalışmasında SSV ile melatonin birlikte uygulanmıştır. Bu çalışmanın sonuçları, in vitro gelişen sekiz hücreli aşamada fare embriyolarına SSV vitrifikasyon uygulanması ve çözündürme sonrası embriyo kültür medyumuna melatonin ilavesinin; in vitro gelişimi desteklediğini, toplam hücre sayısını artırdığını göstermektedir. Bu bilgiler ışında, laboratuvar hayvanları, çiftlik hayvanları ve beşeri alanda uygulanan vitrifikasyon yöntemlerinde destekleyici olarak çözündürme sonrası kültür medyumlarına melatonin ilavesi önerilebilir.

Konu ile ilgili yapılan birçok araştırmada embriyonun ve germ hücrelerinin korunmasında da melatonin önemli rol oynadığı gösterilmiştir. Kültür ortamının melatonin ile takviyesinin canlılığı önemli ölçüde artırdığı, oosit maturasyonu, in vitro fertilizasyonu ve in vitro blastosit gelişimini desteklediği görülmektedir. Melatonin ile ilgili bundan sonraki araştırmalarda, farklı türlere ait, farklı aşamalardaki embriyoların in vitro gelişimini destekleyen ideal melatonin konsantrasyonların belirlenmesi ve melatoninin in vitro gelişimi desteklemesi ile ilgili moleküler mekanizmaların araştırılması önemli olacaktır.

50 6.KAYNAKLAR

Anonim (2018a). Ulusal çevre sağlığı bilimleri enstitüsünden alıntı https://www.niehs.nih.gov/research/resources/visual-guides/guides/male-

repro/index.cfm Erişim tarihi: 04.04.2017

Anonim (2018b). https://www.benbest.com/cryonics/viable.html Erişim tarihi: 07.04.2018 Anonim (2018c). https://enki-institut.com/de/wissenswertes/qualitativer-schlaf.html Erişim

tarihi: 09.04.2018

Abecia J, Forcada F, Zuniga O. (2002). The effect of melatonin on the secretion of progesterone in sheep and on the development of ovine embryos in vitro. Veterinary research communications, 26(2):151-8.

Abedpour N, Rajaei F. (2015). Vitrification by Cryotop and the Maturation, Fertilization, and Developmental Rates of Mouse Oocytes. Iranian Red Crescent Medical Journal, 17(10):e18172.

Abu Nasar M, Rahman A, Abdullah RB and Khadijah WEW. (2008). A review of reproductive biotechnologies and their application in goat. Biotechnology, 7: 371-384.

Adlam VJ1, Harrison JC, Porteous CM, James AM, Smith RA, Murphy MP, Sammut IA. (2005). Targeting an antioxidant to mitochondria decreases cardiac ischemia-reperfusion injury. The FASEB Journal, 19(9):1088-95.

Ahn HJ, Sohn IP, Kwon HC, Jo DH, Park YD, Min CK. (2002). Characteristics of the cell membrane fluidity, actin fibers, and mitochondrial dysfunctions of frozen-thawed two- cell mouse embryos. Molecular Reproduction and Development, (4):466-76.

Ali AA, Bilodeau JF, Sirard MA. (2003). Antioxidant requirements for bovine oocytes varies during in vitro maturation, fertilization and development. Theriogenology, 59(3- 4):939-49.

Alvarez JG, Storey BT. (1992). Evidence for increased lipid peroxidative damage and loss of superoxide dismutase activity as a mode of sublethal cryodamage to human sperm during cryopreservation. Journal of Andrology, 13(3):232-41.

Aono N, Abe Y, Hara K, Sasada H, Sato E, Yoshida H. (2005). Production of live offspring from Mouse germinal vesicle-stage oocytes vitrified by a modified stepwise method, SWEID. Fertility & Sterility, 84 Suppl 2:1078-82.

Arat S, Caputcu AT, Akkoc T, Pabuccuoglu S, Sagirkaya H, Cirit U, Nak Y, Koban E, Bagis H, Demir K, Nak D, Senunver A, Kilicaslan R, Tuna B, Cetinkaya G, Denizci M, Aslan O. (2011). Using cell banks as a tool in conservation programmes of native domestic breeds: the production of the first cloned Anatolian Grey cattle. Reproduction Fertility and Development, 23(8):1012-23.

Arendt J. (1986). Role of the pineal gland and melatonin in seasonal reproductive function in mammals. Oxford Reviews of Reproductive Biology, 8:266-320.

51

Arendt J. (1998). Melatonin and the pineal gland: Influence on mammalian seasonal and circadian physiology. Reviews of Reproduction, 3(1):13-22.

Asgari Z, Ghasemian F, Ramezani M, Bahadori MH. (2012). The effect of melatonin on the developmental potential and implantation rate of mouse embryos. Cell Journal, 14(3): 203–208.

Ashwood-Smith MJ, Morris GW, Fowler R, Appleton TC, Ashoren R. (1988). Physical factors are involved in the destruction of embryos and oocytes during freezing and thawing procedure. Human Reproduction, 3(6):795-802.

Assou S, Haouzi D, De Vos J, Hamamah S. (2010). Human cumulus cells as biomarkers for embryo and pregnancy outcomes. Molecular Human Reproduction, 16(8):531-8.

Bagis H, Odaman H, Sagirkaya H, Dinye´ss A. (2002). Production of transgenic mice from vitrified pronuclear-stage embryos. Molecular Reproduction and Development, 61(2):173-9.

Bagis H, Odaman Mercan H. (2004a). Effect of chemically defined culture medium supplemented with beta-mercaptoethanol and amino acids on implantation and development of different stage in vivo or in vitro-derived mouse embryos. Molecular Reproduction and Development, 69(1):52-9.

Bagis H, Sagirkaya H, Mercan HO, Dinnye´s A. (2004b). Vitrification of pronuclear-stage mouse embryos on solid surface (SSV) versus in cryotube: comparison of the effect of equilibration time and different sugars in the vitrification solution. Molecular Reproduction and Development, 67: 186–192.

Bagis H, Cetin S, Sekmen S. (2005). The effect of equilibration time on survival and development rates of mouse pronuclear- stage embryos vitrified in solid surface (SSV) and conventional straws: in vitro and in vivo evaluations. Molecular Reproduction and Development, 72(4):494–501.

Bagis H, Arat S, Tas AC, Akkoc T, Cetınkaya G, Taskın AC, Turgut G, Sekmen S. (2009). Yardımcı üreme teknikleri ve transgenik hayvan üretiminde kullanılan yöntemler uygulamalı eğitim kursu. TÜBİTAK Gen Mühendisliği ve Biyoteknoloji Araştırma Enstitüsü. Gebze. sayfa 1-50.

Bagis H, Akkoc T, Taskin C and Arat S. (2010). Comparison of Different Cryopreservation Techniques: Higher Survival and Implantation Rate of Frozen–Thawed Mouse Pronuclear Embryos in the Presence of Beta-Mercaptoethanol in Post-Thaw Culture. Reproduction in Domestic Animals, 45(6):e332-7.

Bahadori MH, Ghasemian F, Ramezan M, Asgari Z. (2013). Melatonin effect during different maturation stages of oocyte and subsequent embryo development in mice. Iranian Journal of Reproductive Medicine, 11(1): 11–18.

Bakaltcheva I, Ganong JP, Holtz BL, Peat RA, Reid T. (2000). Effects of highmolecular- weight cryoprotectants on platelets and the coagulation system. Cryobiology, 40(4):283-93.

52

Baranyai B, Bodo SZ, Dinnyes A and Gócza E. (2005). Vitrification of biopsied mouse embryos. Acta Veterinaria Hungarica, 53(1), 103-112.

Barrett P, Bolborea M. (2012). Molecular pathways involved in seasonal body weight and reproductive responses governed by melatonin. Journal of Pineal Research, 52(4):376- 88.

Baust JM, Van B, Baust JG. (2000). Cell viability improves following inhibition of cryopreservation-induced apoptosis. In Vitro Cellular and Developmental Biology, 36(4):262-70.

Berlinguer F, Leoni G.C, Succu S, Spezzigu A, Madeddu M, Satta V, Bebbere D, Contreras- Solis I, Gonzalez-Bulnes A, Naitana S. (2009). Exogenous melatonin positively influences follicular dynamics, oocyte developmental competence and blastocyst output in a goatmodel. Journal of Pineal Research, 46(4):383-91.

Biggers JD. (1987). Pioneering mammalian embryo culture. In: The Mammalian Preimplantation Embryo. Bavister B (ed.) Plenum Publishing Corporation, New York. syf 1 – 22.

Biggers JD, Gwatkin RB, Brinster RL. (1962). Development of mouse embryos in organ cultures of fallopian tubes on a chemically defined medium. Nature, 26;194: 747-9. Boni R, Tosti E, Roviello S, Dale B. (1999). Intercellular communication in in vivo-and in vitro-

produced bovine embryos. Biology of Reproduction, 61(4):1050-5.

Boonkusol D, Gal AB, Bodo S, Gorhony B, Kitiyanant Y and Dinnyes A. (2006). Gene expression profiles and in vitro development following vitrification of pronuclear and 8‐ cell stage mouse embryos. Molecular Reproduction and Development: Incorporating Gamete Research, 73(6), 700-708.

Bracket A. (1912) Development in vitro de blastodermes et de jeunes embryons de mammiferes. CR Hebd Seances Acad Science Journal, 155,1191-1193.

Bracket A. (1913). Reserches sur le determinisme hereditaire de l’oeuf des mammiferes. Development in vitro de jeunes vesicules blastodermiques du lapin. Archives of Biological, 28:447-503.

Brzezinski A. (1997). Melatonin in humans. The New England Journal of Medicine, 336(3):186-95.

Cabrita E, Robles V, Rebordinos L, Sarasquete C, Herraez MP. (2005). Evaluation of DNA damage in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and gilthead sea bream (Sparus aurata) cryopreserved sperm. Cryobiology, 50(2):144-53.

Caputcu AT, Akkoc T, Cetinkaya G, Arat S. (2013). Tissue cryobanking for conservation