Buffer Concentrado de 11ceto-Testosterona
Adicionar 10ml de Buffer em 90ml de água deionizada. Estocar a 4°C por até dois meses.
Solução de Lavagem
Diluir 5ml da solução de lavagem em um volume total de 2L de água deionizada adicionando 1ml de Tween 20. O Tween 20 é um material viscoso e o volume desejado deve ser coletado com uma seringa.
Reagente Ellman’s
Reconstituir o frasco do reagente Ellman’s em 20ml de água deionizada. A preparação deste reagente deverá ser feita somente na hora do ensaio, no momento de adicionar esse reagente na placa de Elisa.
Diluição do Padrão
Preparar uma solução mãe com 100ul do padrão de 11ceto- Testosterona com 900ul de água deionizada. A solução mãe pode ser estocada a 4°C e estará estável por duas semanas. Numere oito tubos de ensaio.
No tubo 01, coloque 900ul de Buffer adicionando 100ul da solução padrão mãe, totalizando assim um volume de 1ml. No tubo 2, coloque 500ul de Buffer e transfira 500ul do tubo 01 para o tubo 02. No tubo 03, coloque 500ul de Buffer e transfira 500ul do tubo 02 para o tubo 03. Repita essa operação até o tubo 08. Ao final, as concentrações dos tubos serão: 100pg/ml (tubo 01); 50 pg/ml (tubo 02); 25 pg/ml (tubo 03); 12,5 pg/ml (tubo 04); 6,25 pg/ml (tubo 05); 3,13 pg/ml (tubo 06); 1,56 pg/ml (tubo 07) e 0,78 pg/ml (tubo 08) de 11ceto- Testosterona.
Ache Tracer de 11ceto-Testosterona
Reconstituir o AchE tracer em 6ml de Buffer e adicionar 60ul do corante Tracer Dye para facilitar a visualização das tiras.
Antisoro de 11ceto-Testosterona
Reconstituir o antisoro para 11ceto-Testosterona em 6ml de Buffer e adicionar 60ul de corante Antisoro Dye para facilitar a visualização das tiras.
1.4.2. Procedimento
As amostras foram descongeladas até atingir temperatura ambiente e homogeneizadas para o início do procedimento da análise.
O suporte com as tiras foi marcado para posterior identificação das amostras, colocando nas primeiras cavidades, 50µl dos 08 padrões previamente preparado (100; 50; 25; 12,5; 6,25: 3,13; 1,56; 0,78 pg/ml) e 50ul
de amostra no restante das cavidades. Essa análise foi feita em duplicata para os padrões e para as amostras.
Foi adicionado 50µl de AchE Tracer e 50ul de antisoro em todas as cavidades e incubado por 2 horas a temperatura ambiente. Após a incubação, a placa foi lavada, desprezando-se o conteúdo da placa, e adicionando 300µl de solução de lavagem em cada cavidade. A lavagem foi realizada 5 vezes em cada poço.
Após a lavagem, foi adicionado 200ul da solução Ellman’s em todas as cavidades. Essa solução deve ser preparada neste momento.
A placa foi coberta com papel alumínio e incubado por 60~90 minutos. Ler em leitora de microplaca de Elisa a um comprimento de onda de 450nm.
2 - Análises de substratos metabólicos (lipídios totais e proteínas totais)
2.1 - Lipídios Totais
Foram determinados através do método de Frings et al. (1972) os lipídios totais do plasma, que são dosados diretamente, não necessitando de prévia extração, como ocorre com outros tecidos. Para os tecidos que necessitam de prévia extração, foi utilizado o método de Folch et al (1957) adaptada por Parrish (1999) para amostras de organismos aquáticos. Para fígado, músculo branco e gônadas, 100mg de tecido foram pesados em balança de precisão, com sensibilidade para 0,0001g. Já para músculo vermelho, foram pesados 50 mg de tecido na mesma balança.
Em seguida foi adicionado 2 ml de solução de clorofórmio:metanol (2:1) e 0,5 ml de água, e as amostras foram homogeneizadas em microprocessador Sentry ™ modelo Tempest I.Q.2, a 25.000 rpm, por 45 segundos. Após a homogeneização, as amostras foram transferidas para tubos de ensaio com tampa de teflon, e os frascos utilizados na extração foram lavados com mais 1 ml de clorofórmio, para evitar perda de lipídios que ficariam retidos nas paredes do frasco. Os tubos com tampa de teflon contendo as amostras homogeneizadas foram centrifugados a 3.000 rpm por 5 minutos. Após a centrifugação, a camada orgânica (inferior) foi removida através da técnica das 2 pipetas. Esta técnica consiste em colocar uma pipeta Pasteur longa dentro de
outra curta. Com esta pipeta curta, a camada inferior é retirada e transferida para outro frasco. A pipeta curta foi lavada com clorofórmio, e o processo foi repetido por 3 vezes, para extração total dos lipídios teciduais. Os extratos finais foram transferidos para frascos menores, e as amostras foram evaporadas em estufa por 12 horas a 55ºC. Após a evaporação, as amostras foram re-suspendidas em 1 ml de clorofórmio e agitadas em Vórtex por 30 segundos, para re-suspensão completa e posterior dosagem.
Para a determinação dos lipídios totais foram pipetados 20ul de plasma ou do extrato já re-suspendido obtido do método de Folch, e no caso das amostras de músculo branco, foi pipetado 100ul, que foram acrescentados a um tubo de ensaio e adicionados de 200 ul de ácido sulfúrico concentrado. Os tubos foram levados a um banho fervente por 10 minutos e em seguida, adicionado 5 ml do reagente de fosfovanilina (vanilina + ácido fosfórico + H2O
destilada). Os tubos foram novamente levados para banho, agora a 370C, por 15 minutos e em seguida foi realizada a leitura da absorbância em espectrofotômetro, a 540nm. A quantidade de lipídios totais foi calculada contra uma curva padrão de óleo de fígado de bacalhau (Cod liver oil fatty acid methyl esters, SIGMA).
2.2 - Proteínas totais
A concentração de proteínas totais no plasma foi determinada pelo método de Lowry et al., (1951). O teor protéico dos tecidos foi determinado pela mesma metodologia, após precipitação e solubilização das proteínas totais segundo metodologia de Milligan & Girard (1993). Na determinação de proteínas totais, o plasma foi inicialmente diluído (fator de diluição a ser determinado em experimentos piloto) com água destilada. Em tubos de ensaio foi adicionada mistura reativa (tartarato de sódio e potássio + sulfato de cobre + carbonato de sódio em hidróxido de sódio). Após 10 minutos, foi adicionado o reativo de Folin-Ciocalteau diluído (1:1) e após 30 minutos a absorbância foi lida em espectrofotômetro em um comprimento de onda de 660nm, contra uma curva padrão de albumina sérica bovina (serum bovine albumine, Sigma).