Çalışmamızda iki ayrı deney protokolü uygulandı. İlk protokol sitalopram zehirlenmesinde oluşan kardiyovasküler toksik etkilerin mekanizmasında adenozin reseptörlerinin rolünü ortaya koymak
etkilerin mekanizmasında endojen adenozinin rolünün tam olarak aydınlatılabilmesi amacıyla planlandı.
VII. F. 1.
Protokol 1. Sitalopram Zehirlenmesinde Oluşan Kardiyovasküler Toksik Etkilerin Mekanizmasında Adenozin Reseptörlerinin Rolü
VII. F. 1. a.
Ön Çalışma: Sitalopramın kardiyovasküler toksik etki yapan dozunun bulunması:
Yapılan ön çalışmalarda sitalopram ile doz-cevap eğrisi elde etmek amacıyla sıçanlara 0.5 mg/kg/dk (n=3), 1mg/kg/dk (n=3), 2mg/kg/dk (n=5), 4mg/kg/dk (n=5) ve 8mg/kg/dk (n=2) dozunda sitalopram 60 dakika boyunca sol eksternal juguler venden infüze (infüzyon hızı:0.05 ml/kg/dk) edildi. 8 mg/kg/dk sitalopram infüzyonu uygulanan sıçanlar yaklaşık olarak 15. dakikada kaybedildi. Daha fazla sitalopram ve deney hayvanı sarfına yol açmamak için 8 mg/kg/dk infüzyon uygulamasına devam edilmedi.
0.5 mg/kg/dk Sitalopram İnfüzyonunun Kardiyovasküler Parametreler Üzerine Etkisi (n=3):
0.5 mg/kg/dk sitalopram infüzyonu başlangıç değerleri ile karşılaştırıldığında, OAB’da 40., 50. ve 60.dakikalarda istatistiksel olarak anlamlı azalma (%100.0±0.0, %70.6±4.9, %67.0±7.0 ve %63.7±8.2, sırasıyla p<0.05, p<0.01, p<0.01 ) oluşturdu. Bu dozda infüze edilen sitalopram başlangıç değerleri ile karşılaştırıldığında, KAH’da 50. ve 60. dakikalarda istatistiksel olarak anlamlı bir azalma meydana getirdi (%89.7±3.0 ve %87.6 ±4.0; sırasıyla p<0.05 ve p<0.01). EKG’de QT ve QRS sürelerinde anlamlı bir değişikliğe yol açmadı (p>0.05).
1 mg/kg/dk Sitalopram İnfüzyonunun Kardiyovasküler Parametreler Üzerine Etkisi (n=3):
1 mg/kg/dk sitalopram infüzyonu başlangıç değerleri ile karşılaştırıldığında, OAB’da, 30., 40., 50. ve 60. dakikalarda istatistiksel olarak anlamlı azalma (%100.0±0.0, %64.6±5.2, %64.5±5.3, %61.5±8.1 ve %57.6±5.2; sırasıyla p<0.01, p<0.01, p<0.01, p<0.001) oluşturdu. Bu dozda infüze edilen sitalopram başlangıç değerleri ile karşılaştırıldığında KAH’da 60. dakikada anlamlı bir azalma oluşturdu (%100.0±0.0, %71.4±11.2, p<0.05). Bu dozda uygulanan sitalopram, QT süresinde 20. ve 30. dakikalarda istatistiksel olarak anlamlı uzamaya yol açarken (%100.0±0.0, %152.8±10.0 ve %158.3±14.4, p<0.05, tüm dakikalarda), QRS süresinde ise anlamlı bir değişiklik oluşturmadı (p>0.05).
2 mg/kg/dk Sitalopram İnfüzyonunun Kardiyovasküler Parametreler Üzerine Etkisi (n=5):
2 mg/kg/dk sitalopram infüzyonu başlangıç değerleri ile karşılaştırıldığında, OAB’da 30., 40., 50. ve 60. dakikalarda istatistiksel olarak anlamlı azalma oluşturdu (%100.0±0.0, %76.4±4.2, %66.1±4.1, %55.2±11.3 ve %47.8±11.3; sırasıyla p<0.05, p<0.001, p<0.001 ve p<0.001). Bu dozda uygulanan sitalopram infüzyonu başlangıç değerleri ile karşılaştırıldığında, KAH’da 40., 50. ve 60. dakikalarda anlamlı azalma yaparken (%100.0±0.0, %72.2±10.4, %65.1±9.2 ve %64.5±10.4; sırasıyla p<0.05, p<0.01 ve p<0.01), EKG’de QT ve QRS sürelerinde anlamlı bir değişikliğe yol açmadı (p>0.05).
4 mg/kg/dk Sitalopram İnfüzyonunun Kardiyovasküler Parametreler Üzerine Etkisi (n=5):
4 mg/kg/dk sitalopram infüzyonu başlangıç değerleri ile karşılaştırıldığında, OAB’da 10., 20., 30., 40., 50. ve 60. dakikalarda istatistiksel olarak anlamlı azalma oluşturdu (%100.0±0.0, %83.6±7.0, %69.6±5.3, %69.0±5.1, %57.4±4.2, %49.7±6.9 ve %35.6±11.3; p<0.001, tüm dakikalarda). Bu dozda infüze edilen sitalopram başlangıç değerleri ile karşılaştırıldığında KAH’da 10., 20., 30., 40., 50. ve 60. dakikalarda anlamlı azalma yaptı (%100.0±0.0, %87.0±7.0, %77.3±9.3, %68.6±10.4, %58.8±7.4, %59.8±10.1 ve %67.8±4.4; p<0.001, tüm dakikalarda). EKG’de QT süresinde 10., 20., 30, 40, 50 ve 60. dakikalarda (%100.0±0.0, %118.2±12.7, %133.0±14.8, %151.0±14.4, %161.1±19.4, %171.0±15.6 ve %171.4±15.7, p<0.001, tüm dakikalarda), QRS süresinde ise 10., 20, 30, 40, 50 ve 60. dakikalarda (%100.0±0.0, %136.0±20.2, %170.3±23.8, %169.7±23.0, %191.7±22.7, %186.7±21.8 ve %218.3±16.7; p<0.001, tüm dakikalarda) anlamlı uzamaya yol açtı.
Sitalopram doz-cevap eğrisi sonuçları değerlendirildiğinde; OAB’ta 10. dakikadan itibaren anlamlı azalma oluşturan 4 mg/kg/dk sitalopram infüzyon dozunun deney gruplarında kullanılmasına karar verildi. Aynı zamanda, 4 mg/kg/dk sitalopram infüzyonunun KAH’da 10. dakikadan itibaren anlamlı azalma yaptığı, EKG’de QT ve QRS sürelerinde 10. dakikadan itibaren anlamlı uzamaya yol açtığı bulundu. Bu sonuçlar göz önüne alındığında, sıçanlarda sitalopram ile kardiyovasküler toksisite modeli oluşturulmasında 4 mg/kg/dk sitalopram infüzyonu uygulanmasına karar verildi (Tablo 3).
a , p<0.05; aa , p<0.01; aaa , p< 0.001; Başlangıca göre anlamlılığı gösteriyor. b, p<0.05; bb, p<0.01; bbb, p<0.001; 10. dakikaya göre anlamlılığı gösteriyor. c, p<0.05; cc, p<0.01, ccc, p< 0.001; 20. dakikaya göre anlamlılığı gösteriyor. d, p<0.01; dd, p< 0.001; 30. dakikaya göre anlamlılığı gösteriyor.
e, p< 0.001; 40. dakikaya göre anlamlılığı gösteriyor. f, p< 0.001; 50. dakikaya göre anlamlılığı gösteriyor.
Başlangıç 10.dakika 20.dakika 30.dakika 40.dakika 50.dakika 60.dakika
OAB (mmHg)
0.5mg/kg/dk 111.8 ± 7.4 100.4 ± 13.3 99.4 ± 13.6 86.5 ± 17.9 79.0 ± 7.9a 74.9 ± 8.7aa 70.9 ± 8.9aa, b,c
1 mg/kg/dk 102.2 ± 2.3 90.7 ± 1.2 87.7 ± 6.2 65.8 ± 4.5aa, b 65.7 ± 4.1aa, b 62.7 ± 7.4aa, b,c 58.8 ± 5.0aaa, bb,c
2 mg/kg/dk 110.4 ± 5.1 95.5 ± 8.3 95.2 ± 10.5 84.6 ± 6.4a 73.1 ± 5.7aaa 61.9 ± 12.7aaa,bb,cc 54.2 ± 13.1aaa, bbb,ccc,d
4 mg/kg/dk 114.3 ± 4.6 92.0 ± 11.9aaa 77.4 ± 12.2aaa,bbb 78.2 ± 7.5aaa,bbb,ccc 65.2 ± 6.4aaa,bbb,ccc,dd 55.9 ± 6.9aaa,bbb,ccc, dd,e 37.6 ± 10.7aaa,bbb,ccc, dd,e,f
KAH (atım/dakika)
0.5mg/kg/dk 420.0 ± 25.3 413.3 ± 25.8 407.0 ± 31.4 394.0 ± 40.8 389.7 ± 31.3 378.0 ± 33.3a 369.3 ± 34.2aa, b,c
1 mg/kg/dk 433.7 ± 7.3 418.0 ± 11.6 409.0 ± 17.8 391.7 ± 9.8 329.0 ± 50.1 313.3 ± 50.9 309.3 ± 46.9a
2 mg/kg/dk 426.4 ± 11.9 404.4 ± 14.9 396.0 ± 18.9 374.8 ± 15.7 305.8 ± 39.8a 275.8 ± 35.9aa, b,c 274.0 ± 42.4aa, b,c
4 mg/kg/dk 458.2 ± 16.4 386.4 ± 32.8aaa 346.0 ± 39.5aaa,bbb 329.8 ± 40.5aaa,bbb,ccc 281.8 ± 22.5aaa,bbb,ccc,dd 294.0 ± 33.2aaa,bbb,ccc,dd,e 303.3 ± 17.1aaa,bbb,ccc,dd,e,f
QT (msn)
0.5mg/kg/dk 29.0 ± 9.5 29.7 ± 11.7 24.0 ± 9.8 28.3 ± 8.8 29.0 ± 10.0 30.3 ± 11.3 27.7 ± 9.7 1 mg/kg/dk 17.0 ± 3.6 18.7 ± 5.8 26.3 ± 6.8 a 26.7 ± 5.7a, b 21.0 ± 7.0 23.3 ± 5.9 24.3 ± 4.8
2 mg/kg/dk 27.2 ± 4.9 32.8 ± 8.5 34.2 ± 8.9 35.8 ± 10.0 42.8 ± 16.9 64.0 ± 25.7 41.8 ± 17.8
4 mg/kg/dk 22.8 ± 5.1 26.4 ± 4.9aaa 28.4 ± 5.4aaa,bbb 30.5 ± 7.4aaa,bbb,ccc 31.0 ± 8.2aaa,bbb,ccc,dd 35.8 ± 11.8aaa,bbb,ccc,dd,e 39.0 ± 14.0aaa,bbb,ccc,dd,e,f
QRS (msn)
0.5mg/kg/dk 17.0 ± 5.5 18.7 ± 4.6 19.0 ± 5.6 16.7 ± 5.5 15.7 ± 5.4 14.7 ± 6.2 19.7 ± 4.9 1 mg/kg/dk 11.0 ± 1.0 16.0 ± 6.1 14.3 ± 4.9 16.3 ± 5.4 13.7 ± 3.3 9.3 ± 2.0 16.0 ± 4.6 2 mg/kg/dk 12.4 ± 1.1 14.2 ± 3.3 13.6 ± 3.4 13.8 ± 3.4 14.6 ± 3.3 15.6 ± 2.9 15.8 ± 3.2
4 mg/kg/dk 11.2 ± 0.5 16.0 ± 2.6aaa 19.6 ± 2.2aaa,bbb 20.3 ± 2.6aaa,bbb,ccc 22.5 ± 2.7aaa,bbb,ccc, dd 22.0 ± 2.2aaa,bbb,ccc,dd,e 24.0 ± 2.0aaa,bbb,ccc,dd,e,f
VII. F. 1. b.
VII. F. 1. b. 1. Ön Çalışma: Sodyum kromoglikatın mast hücrelerini stabilize eden ancak kardiyovasküler parametreleri etkilemeyen dozunun bulunması: Tüm deney gruplarına cerrahi işlemler ve stabilizasyon periyodunun tamamlanmasını takiben adenozinin A3
reseptörlerinin yaptığı mast hücre degranülasyonu sonucu salınan mediyatörlere bağlı gelişebilecek kardiyovasküler etkileri önlemek amacıyla sodyum kromoglikatın (mast hücre stabilizatörü) intravenöz (iv) bolus olarak verilmesi planlandı.
Bu amaçla sodyum kromoglikatın mast hücrelerini stabilize eden ancak kardiyovasküler parametreleri etkilemeyen dozunun bulunması amacıyla doz-cevap eğrisi çalışmaları yapıldı. Cerrahi işlemleri takiben stabilizasyon periyodunu tamamlayan sıçanlara 5 mg/kg (n=2),
10 mg/kg (n=3) ve 20 mg/kg (n=3) iv bolus sodyum kromoglikat femoral venden verilerek kardiyak parametreler (OAB, KAH, EKG’de QRS ve QT süresi) üzerine etkisi 10 dakika boyunca değerlendirildi. Sodyum kromoglikat doz-cevap eğrisi sonuçları tablo 4’de gösterilmiştir.
VII. F. 1. b. 2. Sodyum Kromoglikatın Kardiyovasküler Parametreler Üzerine Etkisi: 5 mg/kg sodyum kromoglikat iv bolus uygulaması başlangıç değerleri ile karşılaştırıldığında, OAB’da 5.dakikada istatistiksel olarak anlamlı azalma oluşturdu (%100.0±0.0, %77.1±9.1 p<0.05, Tablo 4). 10 mg/kg sodyum kromoglikat iv bolus uygulaması başlangıç değerleri ile karşılaştırıldığında, OAB’da 3, 5 ve 10. dakikalarda istatistiksel olarak anlamlı azalma oluşturdu (%100.0±0.0, %68.7±4.9, %54.8±3.0 ve %63.1±3.7, p<0.05, p<0.01, p<0.01, sırasıyla, Tablo 4). 20 mg/kg sodyum kromoglikat iv bolus uygulaması başlangıç değerleri ile karşılaştırıldığında, OAB’da istatistiksel olarak anlamlı değişiklik oluşturmadı (%100.0±0.0, %105.3 ± 2.2, %101.5±1.0 ve %104.4 ± 4.9, p>0.05, sırasıyla, Tablo 4).
5, 10 ve 20 mg/kg sodyum kromoglikat iv bolus uygulaması başlangıç değerleri ile karşılaştırıldığında, KAH, QRS ve QT sürelerinde istatistiksel olarak anlamlı bir değişiklik oluşturmadı (p>0.05, Tablo 4)
Sodyum kromoglikat doz-cevap eğrisi sonuçları değerlendirildiğinde; 10 dakikalık süre boyunca OAB, KAH, QRS ve QT sürelerinde istatistiksel olarak anlamlı değişiklik oluşturmadığı saptanan dozun (20 mg/kg iv bolus) deney protokollerinde kullanılması uygun
Tablo 4. Sodyum kromoglikatın kardiyovasküler parametreler üzerine etkisi
Veriler % cevap olarak gösterilmiştir.
* p<0.05, ** p<0.01, başlangıç değerlerine göre anlamlılığı göstermektedir.
Başlangıç 3.dakika 5.dakika 10.dakika
OAB (%) 5 mg/kg 100.0 ± 0.0 81.0 ± 7.5 77.1 ± 9.1 * 77.7 ± 7.0 10 mg/kg 100.0 ± 0.0 68.7 ± 4.9 * 54.8 ± 3.0 ** 63.1 ± 3.7 ** 20 mg/kg 100.0 ± 0.0 105.3 ± 2.2 101.5 ± 1.0 104.4 ± 4.9 KAH (%) 5 mg/kg 100.0 ± 0.0 88.2 ± 7.4 87.7 ± 6.9 88.4 ± 4.3 10 mg/kg 100.0 ± 0.0 95.2 ± 4.0 89.3 ± 3.5 90.7 ± 5.4 20 mg/kg 100.0 ± 0.0 96.7 ± 4.5 96.8 ± 4.7 98.2 ± 3.2 QT (%) 5 mg/kg 100.0 ± 0.0 116.7 ± 16.7 106.3 ± 6.3 108.4 ± 8.4 10 mg/kg 100.0 ± 0.0 93.8 ± 9.6 98.9 ± 5.5 91.2 ± 3.1 20 mg/kg 100.0 ± 0.0 110.6 ± 7.5 107.6 ± 10.8 122.5 ± 6.8 QRS (%) 5 mg/kg 100.0 ± 0.0 124.1 ± 15.9 104.2 ± 4.2 112.1 ± 7.9 10 mg/kg 100.0 ± 0.0 86.0 ± 7.7 88.5 ± 7.9 89.1 ± 12.1 20 mg/kg 100.0 ± 0.0 101.0 ± 5.0 109.1 ± 11.0 110.5 ± 10.8
VII. F. 1. c. Deney protokolü -1:
Stabilizasyon periyodunu takiben tüm sıçanlara 20mg/kg iv sodyum kromoglikat uygulandı. Sodyum kromoglikat uygulanmasını takiben 10 dakika beklendi. Sıçanlar randomize olarak 4 gruba ayrıldı.
Grup 1 (Kontrol grubu, n=7): %5 dekstroz (0.05 ml/kg/dk hızda) 20 dakika süreyle infüzyonla verildi. %5 dekstroz infüzyonundan sonra, ön çalışmada bulunan 4 mg/kg/dk sitalopram dozu 0.05 ml/kg/dk hızında infüzyona başlanarak 60 dakika boyunca OAB, KAH, QRS, QT süreleri ve yaşam süreleri kaydedildi.
Grup 2 (DPCPX grubu, n=7): 20 dakika süreyle DPCPX (8-Cyclopentyl-1,3- Dipropylxanthine, selektif adenozin A1 reseptör antagonisti, 20 mg/kg/dk dozda ve 0.05
ml/kg/dk hızda) infüzyonla verildi (35). DPCPX infüzyonundan sonra ön çalışmada bulunan 4 mg/kg/dk sitalopram dozu 0.05 ml/kg/dk hızında infüzyona başlanarak 60 dakika boyunca OAB, KAH, QRS, QT süreleri ve yaşam süreleri kaydedildi.
Grup 3 (CSC grubu, n=7): 20 dakika süreyle CSC (8-(3-chlorostyryl)caffeine, selektif adenozin A2a reseptör antagonisti, 24 mg/kg/dk dozda ve 0.05 ml/kg/dk hızda) infüzyonla
verildi (35). CSC infüzyonundan sonra ön çalışmada bulunan 4 mg/kg/dk sitalopram dozu 0.05 ml/kg/dk hızında infüzyona başlanarak 60 dakika boyunca OAB, KAH, QRS, QT süreleri ve yaşam süreleri kaydedildi.
Grup 4 (DMSO grubu, n=3): 20 dakika süreyle %10 DMSO (dimetil sülfoksid, DPCPX ve CSC’nin çözücüsü) 0.05 ml/kg/dk hızında infüzyonla verildi. %10 DMSO infüzyonundan sonra ön çalışmada bulunan 4 mg/kg/dk sitalopram dozu 0.05 ml/kg/dk hızında infüzyona başlanarak 60 dakika boyunca OAB, KAH, QRS, QT süreleri ve yaşam süreleri kaydedildi.
Şekil 6: Deney Protokolü 1
Grup 1(kontrol grubu, n=7)
15 dakika 10 dakika 20 dakika 60 dakika Stabilizasyon Sodyum kromoglikat (20 mg/kg iv bolus) % 5 dekstroz infüzyonu Sitalopram infüzyonu (4 mg/kg/dk) Grup 2 (DPCPX grubu, n=7)
15 dakika 10 dakika 20 dakika 60 dakika Stabilizasyon Sodyum kromoglikat (20 mg/kg iv bolus) DPCPX infüzyonu (20mg/kg/dk) Sitalopram infüzyonu(4 mg/kg/dk) Grup 3 (CSC grubu, n=7)
15 dakika 10 dakika 20 dakika 60 dakika Stabilizasyon Sodyum kromoglikat (20 mg/kg iv bolus) CSC infüzyonu (24mg/kg/dk) Sitalopram infüzyonu (4 mg/kg/dk)
Grup 4 (DMSO grubu, n=3)
15 dakika 10 dakika 20 dakika 60 dakika Stabilizasyon
Sodyum kromoglikat (20 mg/kg iv bolus)
%10 DMSO
infüzyonu Sitalopram infüzyonu 4 mg/kg/dk
VII. F. 2.
Protokol 2: Sitalopram Zehirlenmesinde Oluşan Kardiyovasküler Toksik Etkilerin Mekanizmasında Endojen Adenozinin Rolü
VII. F. 2. a. Ön Çalışma
Deneyde kullanılan EHNA (erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl) adenine; adenozin deaminaz
inhibitörü) ve NBTI ‘nın (S-(4-nitrobenzyl)-6-thioinosine; adenozin transport inhibitörü)
çözücüsü olan % 10 DMSO’nun (dimetil sülfoksit) etkilerini göstermek amacıyla bir ön çalışma planlandı (n=3). Bu çalışmaya göre; %10 DMSO endojen adenozin konsantrasyonlarını artırmadı (0.7293±0.06742, 0.6823±0.1916; p>0.05, sırasıyla deney başlangıcı plazma adenozin düzeyi ve deney sonu plazma adenozin düzeyi). Ayrıca %10 DMSO uygulanması kardiyovasküler parametrelerde herhangi bir değişikliğe yol açmadı.
VII. F. 2. b. Deney Protokolü -2
Deneye başlamadan 15 gün önce, bazal plazma adenozin düzeylerinin saptanması amacıyla her bir sıçandan, 2 ml/hafta olacak şekilde toplam 4 ml kan alındı. Bu işlem sıçanın kuyruk veninden ve eter anestezisi altında uygulandı. Sıçanların hemodinamisinin düzelmesi için 1 hafta süreyle beklendi.
Sıçanlar randomize olarak 3 gruba ayrıldı (n=8, her bir grup için)
Grup 1 (Kontrol grubu, n=8): Kanülasyondan 1 saat önce sıçanlara deney gruplarına eşit volümde %5 dekstroz i.p (0.5 mI) verildi. Stabilizasyon periyodunu takiben çalışmada bulunan 4 mg/kg/dk sitalopram dozu 0.05 ml/kg/dk hızında infüzyona başlanarak 60 dakika boyunca OAB, KAH, QRS ve QT süreleri ve yaşam süreleri kaydedildi (Şekil 7).
Grup 2 (n=8): Kanülasyondan 1 saat önce sıçanlara adenozin deaminaz (ADA) inhibitörü erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl) adenine (EHNA, 10 mg/kg, i.p) ardından adenozin transport inhibitörü S-(4-nitrobenzyl)-6-thioinosine (NBTI, 1mg/kg, i.p) (toplam volüm 0.5 mL) verildi (88). Stabilizasyon periyodunu takiben 0.05 ml/kg/dk hızında % 5 dektroz infüzyonuna başlanarak 60 dakika boyunca OAB, KAH, QRS ve QT süreleri ve yaşam süreleri kaydedildi
Grup 3 (n=8): Kanülasyondan 1 saat önce sıçanlara ADA inhibitörü erythro-9-(2-hydroxy-3- nonyl) adenine (EHNA, 10 mg/kg, i.p), adenozin transport inhibitörü ardından S-(4- nitrobenzyl)-6-thioinosine (NBTI, 1mg/kg, i.p) (toplam volüm 0.5 mL) verildi (88). Stabilizasyon periyodunu takiben ön çalışmada bulunan 4 mg/kg/dk sitalopram dozu 0.05 ml/kg/dk hızında infüzyona başlanarak 60 dakika boyunca OAB, KAH, QRS ve QT süreleri ve yaşam süreleri kaydedildi (Şekil 7).
60. dakikanın sonunda anestezi altındaki tüm sıçanlardan kanüle edilmiş olan karotis arterinden 4 ml kan alındı. Tüm kan örnekleri (3.6ml), içerisinde 0.4 ml stopping solüsyonu bulunan tüplere alındı. Örnekler hızlı bir şekilde 14,000 x g’de 2 dakika santrifüj edildi. Plazma 1ml’lik eşit kısımlar şeklinde ayrı tüplere alınarak plazma adenozin konsantrasyonları ölçülmek üzere -800C’ de saklandı.
Hazırlanan stopping solüsyonunun içeriği:
1- Adenozin geri-alımını engellemek ve kırmızı kan hücrelerinden salınımını sağlamak amacıyla 1 mM dilazep.
2- Adenozin deaminaz inhibisyonu amacıyla 10 µM erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl) adenine (EHNA)
3- Trombositlerden nükleotid salınımını inhibe etmek amacıyla 2µg/ml indometazin
4- Trombosit agregasyonunu önlemek ve trombositlerden adenozin salınımını inhibe etmek amacıyla 40 µM etilendiamin tetraasetik asid (EDTA) ve 40 µM O,O’-bis (2 aminoetil) etileneglikol-N,N,N’-N’-tetraasetikasid (G-EDTA).
Şekil 7: Deney Protokolü 2 Grup 1 (kontrol grubu, n=8)
Deneyden 15 gün önce Deney günü Kan alınması (bazal plazma adenozin düzeyi ölçümü için)
1 saat önce 10 dakika 15 dakika 60 dakika
Kan alınması (plazma adenozin düzeyi ölçümü için) %5 dekstroz i.p Cerrahi işlem
Stabilizasyon Sitalopram infüzyonu (4 mg/kg/dk) Grup 2(n=8) Deneyden 15 gün önce Deney günü Kan alınması (bazal plazma adenozin düzeyi ölçümü için)
1 saat önce 10 dakika 15 dakika 60 dakika
Kan alınması (plazma adenozin düzeyi ölçümü için) EHNA (10 mg/kg i.p) + NBTI (1mg/kg i.p ) Cerrahi
işlem Stabilizasyon % 5 dekstrozinfüzyonu
Grup 3(n=8) Deneyden 15 gün önce Deney günü Kan alınması (bazal plazma adenozin düzeyi ölçümü için) 1 saat önce 10
dakika 15 dakika 60 dakika Kan alınması (plazma adenozin düzeyi ölçümü için) EHNA (10 mg/kg i.p) + NBTI (1mg/kg i.p ) Cerrahi işlem
Stabilizasyon Sitalopram infüzyonu (4 mg/kg/dk)
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 mV(x100) Detector A:Ex:280nm,Em:380nm A D E N O S IN E /10574508 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0min 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1mV(x1,000)Detector A:Ex:280nm,Em:380nm /6.038/ 135638 /8.138/ 214968 /8.806/ 94128 AD EN OS IN /10.167/ 8799218 /10.925/ 17665386 /12.088/ 751725 /13.235/ 295293 /13.672/ 265411 /14.475/ 220124
VII. F. 2. c. Plazma Adenozin Düzeylerinin Ölçümü
– 80oC’de saklanan bazal ve deney sonu kan örneklerinden, plazma adenozin düzeyi ölçümleri HPLC (high pressure liquid chromatography) ile yapıldı. Ölçüm için aşağıdaki protokol izlendi (89,90);
300 mikrolitre (μl) serum örneği üzerine, 30 μl %50’lik triklorasetik asid (TCA) eklendi ve vortekslendi. 15300 rpm’de 10 dakika santrifüje edildi. Elde edilen süpernatanttan 150 μl alınarak, üzerine 20 μl 3,3 N potasyum hidroksid (KOH) eklendi ve vortekslendi. Elde edilen karışımın üzerine 100 μl 1 M çinko sülfat (ZnSO4) eklendi ve vortekslendi. Bu karışımın
üzerine de 200 μl satüre baryum hidroksid [Ba(OH)2] eklendi ve tekrar vortekslendi. 15300
rpm’de 10 dakika santrifüje edildi. Elde edilen süpernatanttan 200 μl alındı ve üzerine 20 μl 440 mM klorasetaldehid eklenerek vortekslendi.+80oC’de 1 saat inkübe edildi. Reaksiyonu durdurmak için 10 dakika buz üzerinde soğutma uygulandı. 5000 rpm’de 5 dakika santrifüj edildi. HPLC cihazına 20 μl enjeksiyon yapılarak analiz gerçekleştirildi. Her örnekten iki ölçüm yapıldı. İki ölçüm arasındaki farkın %15’ den daha fazla saptandığı durumda ölçüm tekrar edildi. İstatistiksel değerlendirme için iki ölçümün ortalaması alındı.
Recovery çalışmaları: 0.1, 0.3, 0.5, 1, 3, 5, 10mM adenozin içeren plazma örneklerinden kalibrasyon eğrisi elde edilerek yapıldı. Standart kromotogram ve sıçan plazma örneklerinden elde edilen kromotogram aşağıda verilmiştir (Şekil 8,9).
Şekil 8: Standart kromotogram Şekil 9: Sıçan plazma örneklerinden elde edilen kromotogram
HPLC-fluorometrik analiz: HPLC fluorometrik sistemi (Shimadzu, Osaka, Japan), SIL 20 AC auotsampler, LC-20AD pompa ve RF-10AXL floresan detektör içermektedir. Mobil faz A; %88’lik 0,01 M KH2PO4 (pH:3.5), %12 metanol (vol/vol), mobil faz B; %50’lik 0,01 M KH2PO4 (pH:3.5), %50’lik metanol(vol/vol) içermektedir. 0,7 ml/dakika hızında ve
Macherey-Nagel C18 5mM kolonu kullanılarak analizler gerçekleştirildi. Floresan aktivite 280
nm eksitasyon dalga boyu ve 380 nm emisyon dalga boyunda saptandı. Adenozin retansiyonu zamanı 10.1 dakika olarak tespit edildi.
VII. F. 3. İstatistiksel Analiz:
İstatistiksel analiz verilerin % cevap değerleri hesaplanarak yapıldı. Grup içi karşılaştırmada tekrarlayan ölçümlerde varyans analizi (ANOVA) ve takiben Tukey-Kramer çoklu karşılaştırma testleri yapıldı. Gruplar arası farkın değerlendirilmesinde ANOVA ve Tukey- Kramer çoklu karşılaştırma testleri uygulandı. Yaşam sürelerinin karşılaştırılması için ise Kaplan-Meier prosedürü ve log-rank testleri kullanıldı (Graphpad Instat V2.05a-1994). Tüm veriler Ortalama ± Standart hata olarak gösterildi. %95 güven aralığı (%95 GA) metin içinde gösterildi. Çalışmada p<0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.