Değerlendirmeler

Com base na resposta imune ao HPV, investigamos possíveis associações entre HPV e avaliação quantitativa da subpopulação linfocitária determinada pela citometria de fluxo (Tabelas 5 a 7 e Figuras 10 a 16).

Na avaliação quantitativa do perfil imunológico determinado pela contagem ds linfócitos T (CD3+) e subpopulações: T helper (CD3+/CD4+) e T supressor/citotóxico (CD3+/CD8+), linfócitos B (CD19+), células NK (CD16- 56+/CD45+) e células NKT (CD3+/CD16-56+), constatou-se elevada contagem de linfócitos TCD8+ predominantemente nas pacientes infectadas por HPV de alto risco quando comparados com mulheres de baixo risco (Tabela 5).

Na mulheres com DNA do HPV de alto risco, 5 das 8 pacientes (62,5%) tiveram aumento da expressão de linfócitos TCD8+. Inversamente, considerando apenas os pacientes com DNA de HPV de baixo risco, apenas 2 das 16 (12,5%) pacientes apresentaram um aumento de linfócitos CD8 positivos T quando comparado com pacientes que exibem alto risco DNA HPV. Além disso, a avaliação quantitativa de CD19 foi normal em pacientes que exibem LSIL e HPV, quando comparado com o grupo controle composto por mulheres saudáveis (Tabela 5).

Nas 30 mulheres pertencentes ao grupo controle, a contagem de linfócitos T variou de 949 a 2.080/mm3 com mediana de 1.303/mm3. A contagem de linfócitos T helper variou de 574/mm3 a 1.216/mm3 com mediana de 777/mm3_{. Para os linfócitos T supressor citotóxico constataram-se os} seguintes níveis: nível mínino 264/mm3_{, máximo 805/mm}3 _{e mediana de} 420/mm3_{. Com relação às contagens de linfócitos B, observaram-se os} seguintes resultados: contagem mínima de 96/mm3_{, máxima de 400/mm}3 _e mediana de 198/mm3_{. A contagem mínima de células NK foi de 130/mm}3_, máxima de 399/mm3 _{e mediana de 232/mm}3_{. A contagem de células NKT foi de} mínimo de 13/mm3; máximo de 184/mm3 e mediana de 70/mm3. Neste grupo de mulheres, todos os parâmetros acima citados bem como a relação

XLIII CD4/CD8 mostraram-se dentro dos limites de normalidade conforme demonstrado anteriormente na tabela 2 (Tabela 6).

No grupo de mulheres infectadas pelo HPV, a contagem de linfócitos T variou de 700 a 4.100/mm3 _{com média de 1.700/mm}3_{. A contagem de linfócitos} T helper variou de 430/mm3 _{a 2.150/mm}3 _{com mediana de 910/mm}3_{. Para os} linfócitos T supressor citotóxico constataram-se os seguintes níveis: contagem mínima de 280/mm3_{, máximo 1.700/mm}3 _{e mediana de 728/mm}3_{. Com relação} às contagens de linfócitos B, observaram-se os seguintes resultados: mínimo de 84/mm3, máximo de 663/mm3 e mediana de 240mm3. A contagem mínima de células NK foi de 12/mm3, máxima de 510/mm3 e mediana de 84,5/mm3. As células NKT por sua vez observou-se ausência dessas células em 5 casos; contagem máxima de 30/mm3 e mediana de 3,3/mm3. Neste grupo, de mulheres, o cálculo da relação CD4/CD8 mostrou variação de 0,73 a 2,65 com mediana de 1,5 (Tabela 7).

A análise estatística dos parâmetros imunológicos dos dois grupos demonstrou diferenças entre si para: contagem de células TCD8 com p= 0,002 (Figura 12), relação CD4/CD8 com p< 0,003 (Figura 13), contagem de células NK com p< 0,0002 (Figura 15) e células NKT com p<0,00001 (Figura 16). Com relação aos parâmetros: linfócitos T total (Figura 10), Linfócitos B total (Figura 14) e linfócitos T helper (Figura 11), não se constataram diferença estatisticamente significativa entre a contagem destas células e os grupos HPV+ e HPV-, sugerindo a pouca influência da fisiopatologia do HPV nestas células do sistema imune a nível sistêmico, ao contrário do observado com as células TCD8+, células NK e NKT.

XLIV Tabela 6. Perfil imunológico das mulheres pertencentes ao grupo controle

Caso n Linf. T CD3/m m3 Linf. Th CD4 /mm3 LTSC CD8 /mm3 Rel. CD4/CD8 Linf. B CD19 /mm3 Cel. NK CD16-56 /mm3 Cel. NKT CD16-56/CD3/mm3 01 1.480 920 600 1,37 260 280 20 02 1.110 660 390 1,69 120 240 60 03 1.000 780 285 1,69 150 315 45 04 1.440 960 580 2,73 160 340 100 05 1.065 690 300 1,65 165 180 75 06 1.794 1038 690 2,3 253 322 23 07 1.479 918 405 1,5 170 255 17 08 1.323 924 462 2 357 231 42 09 1.040 799 630 2 143 156 13 10 1.184 774 268 1,6 128 176 32 11 1.260 738 504 1,95 342 252 108 12 949 624 264 1,5 130 234 78 13 1.050 574 405 2,2 182 182 28 14 1.491 1.092 441 1,4 294 168 105 15 1.110 630 420 2,7 210 210 90 16 2.080 750 650 1,5 286 260 104 17 1.125 660 288 2,0 156 180 78 18 1.072 640 400 2,3 160 240 80 19 988 715 403 1,6 130 130 84 20 1.738 1.144 572 1,8 264 143 132 21 1.800 1.250 475 2,0 400 325 75 22 1.248 800 320 2,0 160 224 32 23 1.541 1.035 667 2,6 230 276 184 24 1.575 840 805 2,5 336 399 84 25 1.088 800 336 1,6 256 208 64 26 1.095 720 495 1,45 165 195 30 27 1.248 720 320 2,25 96 226 64 28 1.541 1.150 667 1,72 230 276 161 29 1.140 750 300 2,5 195 285 45 30 1.050 750 420 1,79 225 165 60 Min. 949 574 264 1,15 65 130 13 Max 2.080 1.250 805 2,75 400 399 184 Med 1.216 777 420 1,87 188 232 69 M 1.316 833 463 1,92 213 237 72

OBS: Linf B. (Linfócitos B), Linf T (Linfócitos T); Linf Th (Linfócitos T helper); Linf TSc

(Linfócitos T supressor citotóxico); Cel. NK (Células Natural Killer); Cel. NKT (Células NKT); (mínimo); Máx. (Máximo); Med. (Mediana), M (Média).

XLV Tabela 7. Perfil imunológico das mulheres infectadas pelo HPV

Caso n Linf. T CD3/mm3 Linf. Th CD4 /mm3 LTSC CD8 /mm3 Rel. CD4/CD8 Linf. B CD19 /mm3 Cel. NK CD16-56 /mm3 Cel. NKT CD1656/CD3/mm3 01 1.079 742 280 2,65 266 42 0 02 1.386 900 594 1,51 180 54 0 03 2.260 1.200 1.170 1,02 300 60 5,4 04 1.234 748 340 2,2 170 51 30 05 700 430 250 1,72 100 20 9 06 1.835 1.248 832 1,52 494 130 1,9 07 1.122 697 425 1,64 153 187 5,1 08 1.292 798 494 1,61 152 152 3,8 09 1.630 672 912 0,73 271 72 12 10 1.216 738 432 1,7 160 48 3,2 11 1.302 630 651 0,96 84 84 0,2 12 2.730 1.287 924 1,39 330 462 9,9 13 2.106 1.439 805 1,78 429 105 3,7 14 2.549 1.517 1.185 1,27 574 164 0 15 1.857 1.350 750 1,8 270 30 0 16 875 600 348 2,5 120 12 0 17 2.160 1.242 702 1,76 405 81 2,1 18 1.770 750 870 0,86 600 90 1,5 19 2.613 874 1.053 1,4 663 174 1,2 20 1.544 1.058 782 1,35 230 69 2 21 2.264 1.320 990 1,33 231 99 1 22 2.678 1.419 1.056 1,34 396 165 3 23 898 552 240 2,3 144 60 6 24 2.016 1.275 650 1,96 250 50 1 25 2.289 1.023 1.147 0,89 310 93 6,2 26 2.040 1.290 750 1,72 120 510 9 27 4.100 2.100 1.700 1,25 650 100 5 28 1.518 902 616 1,46 220 374 6,6 29 1.241 782 510 1,5 102 85 3,4 30 923 650 429 1,51 91 52 9,1 Min. 700 430 280 0,73 84 12 0 Max. 4.100 2.100 1.700 2,65 663 510 30 Med. 1.700 901 726 1,54 240 84,5 3,3 M 1.813 1.006,9 742 1,56 289 131 4,73

OBS: Linf B. (Linfócitos B), Linf T (Linfócitos T); Linf Th (Linfócitos T helper); Linf TSc (Linfócit

supressor citotóxico); Cel. NK (Células Natural Killer); Cel. NKT (Células NKT); Min. (mínimo); M (Máximo); Med. (Mediana); M (Media).

XLVI Figura 6. Distribuição da leucometria em mulheres HPV+ e HPV-.

.

p=0.0002

XLVII Figura 7. Distribuição da contagem de linfócitos em mulheres HPV+ e HPV-.

HPV

+ HPV-

XLVIII Figura 8. Distribuição da contagem de monócitos em mulheres HPV+ e HPV-.

p<0.0001

XLIX Figura 9. Distribuição da contagem de granulócitos em mulheres HPV+ e HPV-.

p=0.01

L Figura 10. Distribuição dos valores de linfócitos TCD3+ em mulheres HPV+ e HPV-.

HPV-

p=0.018

LI Figura 11. Distribuição dos valores de linfócitos BCD19+ em mulheres HPV+ e HPV-.

HPV-

p=0.03

LII Figura 12. Distribuição dos valores de linfócitos TCD4+ em mulheres HPV+ e HPV-.

HPV+ HPV

-

LIII Figura 13. Distribuição dos valores de linfócitos TCD8+ em mulheres HPV+ e HPV-.

LIV Figura 14. Distribuição da relação CD4/CD8 em mulheres HPV+ e HPV-.

p=0.003

LV Figura 15. Distribuição dos valores de células NK (CD16-56+) em mulheres HPV+ e HPV-.

HPV

+ HPV-

LVI Figura 16. Distribuição dos valores de células NKT (CD3+/CD16-56+) em mulheres HPV+ e HPV

p<0.00001

LVII

6 - DISCUSSÃO

A comunidade médica mundial está empenhada na elaboração de programas de vacinação contra o HPV. Antes que estes sejam implementados é importante reconhecer, que talvez este esforço isolado não seja suficiente, uma vez que a erradicação da infecção pelo HPV é também dependente da resposta imune celular. Estudos têm demonstrado níveis significativamente mais baixos de células de defesa tipo TH1 (células de Langerhans) no epitélio cervical de pacientes portadoras de lesões intraepiteliais de alto grau (LIEAG) quando comparadas aquelas encontradas no epitélio cervical de pacientes saudáveis (EVANS et al, 1997; BONTKES et al 2000; ).

Sabe-se ainda que os linfócitos T citotóxicos (LTC) desempenham um papel importante na imunidade local, impedindo a progressão da doença.

Existe na literatura fortes evidências de que os LTC específicos para o HPV de alto poder oncogênico parecem ter um papel central na inibição da carcinogênese cervical (BOR-CHING SHEU, et al.,2007). As referidas células desempenham uma função importante no reconhecimento e defesa contra antígenos específicos do HPV e agindo dessa forma como sentilenas no combate de células infectadas. Trabalhos têm demonstrado que dependendo do tipo de resposta Th específica para o vírus HPV-16 produtor da oncoproteína E7 pode resultar no clearance ou na persistência do vírus em pacientes com neoplasia cervical (DE GRUIJL TD, et al., 1998).

Em estudo prévio, KADISH (2002) avaliou in vitro a resposta imune celular linfoproliferativa aos peptídios E6 e E7 do HPV 16 em 136 mulheres portadoras de NIC (neoplasia intraepitelial cervical) I e II seguidas durante um ano, Neste estudo observou- se que a resposta imune celular ao peptídio E7 esteve relacionada a clarificação da infecção e a regressão da doença neste período de tempo.

O presente estudo teve a finalidade de avaliar o perfil imunológico e a resposta imune sistemica ao HPV, mediante a caracterização quantitativa da subpopulação

LVIII linfocitária do sangue periférico por citometria de fluxo em mulheres infectadas com o HPV de baixo ou alto risco oncogênico e portadoras de LSIL. Estudando também paralelamente mulheres com as mesmas características sem doença, as quais constituiram o grupo contole

Identificamos uma diminuição na contagem de linfócitos TCD4+, com relativo aumento no número de células TCD8+ entre as pacientes acometidos com HPV de alto risco quando comparados com aquelas infectadas com HPV de baixo risco e principalmente com as mulheres pertencentes ao grupo controle (Tabelas 5 a 7 e Figuras 10, 12, 13 e 14). Tal fato sugere que possivelmente, o HPV, especialmente o de alto risco poderia estar induzindo um efeito citopático nos linfócitos TCD4+ como uma estratégia de subverter a resposta imunitária destas pacientes frente à infecção.

Estudos anteriores demonstram que pacientes com câncer cervical foi observado uma perda completa ou uma diminuição da expressão das moléculas de classe I em células tumorais. Este mecanismo poderia representar uma estratégia do vírus para escapar da vigilância imunológica e, consequentemente, não ser reconhecido em virtude da ausência da diminuição da expressão dos antígenos por parte destas moléculas apresentadoras. Consequentemente, as pacientes apresentariam uma redução do número de linfócitos T específicos necessárias para erradicar o vírus. (MONNIER- BENOIT S, et al., 2006; DE BOER MA, et al., 2007). Em contrapartida, KANODIA (2007) observou que a expressão de moléculas imunossupressoras no microambiente cervical favoreceu ao escape viral.

O que nos faz pensar inicialmente que ocorreria uma maior expressão de moléculas imunossupressoras a nível local, que posteriormente seriam inibidas a nível sistêmico. O que justifica nossos achados.

Neste estudo, observamos ainda um decréscimo na quantidade de linfócitos TCD4+ e um acréscimo de TCD8+ nas pacientes infectadas com HPV de alto risco oncogênico, similarmente ao que acontece em pacientes infectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV). Neste caso específico, o mecanismo de apoptose induz a um esgotamento fisiológico dos linfócitos T no curso da infecção viral diminuíndo a

LIX resposta imune e contribuindo desta forma para o quadro de imunodeficiência (WATTRE P, et al., 1996).

Todavia, quando analisamos a população de células NK e NKT, independente do poder oncogênico do HPV, observou-se uma diminuição acentuada nas duas sub- populações avaliadas (Tabelas 5 a 7 e Figuras 15 e 16). O decréscimo observado nestas sub-populações pode estar relacionado com a expressão aumentada de proteínas pro- apoptóticas, que poderia ser decorrente da ativação de mecanismos indutores de apoptose.

Entretanto, não observamamos diferenças significativa na contagem de linfócitos B no sangue periférico nos dois grupos de mulheres estudados (com e sem HPV), o que talvez não ocorresse se tivesse sido avaliado material cérvico vaginal, uma vez que a mucosa genital normal é infiltrada por linfócitos TCD4+, TCD8 + , células plasmáticas , células dendríticas (DCs) e macrófagos (GARCIA-CHACON R, et al. 2009; INSINGA R.P, et al., 2009). Nossos resultados poderiam traduzir ainda uma participação limitada da resposta imune humoral , quando a infecção já está instalada.

Constatamos também uma contagem mais elevada de linfócitos nas pacientes portadoras de HPV. Em adição, outro estudo examinou a expressão aumentada de linfócitos T CD3 entre as pacientes com NIC III (MALUF PJ, et al., 2008). Resultados semelhantes foram observados em uma análise por imunohistoquímica da expressão de células TCD4+ e TCD8+ na presença do HPV de alto risco oncogênico em lesões pré malignas e malignas do colo uterino (MONNIER-BENOIT et al, 2006).

Concluindo, podemos dizer que as respostas imune celular e humoral são essenciais no processo de progressão ou regressão da infecção e ou lesão induzida pelo HPV. Associada a isso, diferentes linhas de pensamento evidenciam principalmente o papel da resposta imune celular neste processo. ( KARIM 2011).

Por outro lado, existe ainda a necessidade de estudos adicionais, como finalidade de entendimento da interação entre o HPV e o hospedeiro, como também da resposta deste hospedeiro ao vírus.

LX

7. CONCLUSÕES

Baseados nos objetivos propostos, concluímos que:

• Observou-se a uma modulação do sistema imune adaptativo a nível sistêmico durante a infecção pelo HPV, independente do grau de oncogenicidade do vírus, sendo pronunciadamente mais evidente na diminuição do número de células NK e NKT e aumento das células TCD8+.

• Durante a infecção pelo HPV as mulheres acometidas com o vírus de alto poder oncogênico apresentam uma modulação da resposta imune adquirida mais acentuada quando comparada com as mulheres infectadas pelo HPV de baixo grau, caracterizada pela diminuição acentuada na contagem de linfócitos TCD4+ com relativo aumento dos linfócitos TCD8+.

• Não foi observada correlação estatisticamente significativa na contagem de células B (CD19+), levando a crer na pouca participaçào desses linfócitos imunidade humoral na resposta imune a nível sistêmico da infecção pelo HPV.

• O aprofundamento nos estudos envolvendo uma maior caracterização imunofenotípica destas células do sistema imune e também a nível local associada a imunobiologia do vírus pode contrubuir de forma significativa aos conhecimentos atuais acerca de prováveis mecanismos entre virus e sistema imune do hospedeiro.

• Esses estudos constitui de uma investgação preliminar para o entendimento da fenotipagem da infecção pelo HPV em mulheres com LSIL.

LXI