Para deletar a região codificadora do gene cspC, as regiões flanqueadoras a montante e a jusante do gene foram amplificadas por PCR com os pares de oligonucleotídeos C3/C4 ou C1/C2, clonadas in tandem e o gene foi substituído por um cassete de resistência a espectinomicina e estreptomicina. Os fragmentos obtidos foram ligados ao vetor pNPTS138, gerando a construção pNPTS138( cspC:: spec) (ver Fig. 13). Este vetor foi introduzido em C. crescentus NA1000 por conjugação, e a deleção do gene ocorreu após dupla recombinação homóloga. As etapas para construção do mutante estão detalhadas a seguir.
3.5.1 Isolamento das regiões flanqueadoras de cspC
A reação de PCR e a clonagem das regiões flanqueadoras de cspC no vetor TOPO foram previamente realizadas em nosso laboratório por Elza Akie Sakamoto Lang. Cada um dos fragmentos flanqueadores de cspC foi isolado para subclonagem no vetor pBluescript KS. Um micrograma de uma minipreparação do vetor TOPO contendo o flanqueador a jusante de cspC (810 pb) foi digerido com ApaI/EcoRI. A digestão foi feita primeiramente com 10 U de ApaI, em tampão fornecido pelo
fabricante, a 30 ºC por 2 horas, em um volume final de 60 l. A seguir, foram adicionadas 10 U de EcoRI em tampão fornecido pelo fabricante, incubando-se a 37 ºC por 2 horas. Oitocentos nanogramas de uma minipreparação do vetor TOPO contendo o flanqueador a montante do gene cspC (570 pb) foram digeridos com 10 U de EcoRI e 10 U de PstI, em tampão próprio da enzima PstI, num volume final de 60 l. A digestão ocorreu a 37 ºC por 2 horas.
Ambas as reações de digestão tiveram suas enzimas inativadas a 80 ºC por 20 minutos, e foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 1% em tampão TBE 1 X. O gel foi corado com brometo de etídeo e os fragmentos desejados foram cortados do gel e eletroeluídos em tampão TBE 0,5 X, a 100 V por 1 hora em membrana de diálise (Pierce Protein Research Products, Rockford, IL, E.U.A.). Os fragmentos foram purificados com fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1) e precipitados com etanol, na presença de acetato de sódio 0,3 M e 10 g de tRNA de levedura, a -20 ºC por 16 horas ou a -80 ºC por 1 hora. Os DNAs foram lavados com etanol 70%, secos e ressuspendidos em 20 l de TE contendo RNAse A (20 g/ml).
3.5.2 Subclonagem dos flanqueadores de cspC no vetor pBluescript KS
O vetor pBluescript KS foi digerido primeiramente com ApaI e EcoRI (5 U de cada), em um volume final de 20 l, e as enzimas foram inativadas como acima. Foi realizada a ligação de 80 ng do vetor digerido com 160 ng do fragmento ApaI/EcoRI eletroeluído, com 1 U de T4 DNA ligase (Invitrogen) em tampão fornecido pelo fabricante. A reação de ligação foi feita à temperatura ambiente por 16 horas, e a seguir foi introduzida por eletroporação em E. coli DH5α, como no item 3.4.3, e as células foram semeadas em placa com meio LB ágar acrescido de ampicilina, X-gal e IPTG. Os clones tiveram os insertos confirmados através de digestão do DNA plasmidial com
ApaI/EcoRI. Uma minipreparação positiva (500 ng) foi digerida com EcoRI/PstI (5 U
de cada enzima, no tampão próprio de PstI), a fim de se efetuar a ligação com o fragmento eletroeluído do outro flanqueador do gene cspC.
A ligação foi realizada com 300 ng do vetor contendo o flanqueador a jusante de
cspC e 600 ng do fragmento EcoRI/PstI eletroeluído (570 pb), e a reação ocorreu a
23 ºC durante 1 hora. Esta ligação foi eletroporada em E. coli DH5α e as células foram semeadas como descrito acima.
Oitocentos nanogramas do vetor pBluescript KS( cspC) e do vetor pHP45 foram digeridos com 5 U de EcoRI em tampão fornecido pelo fabricante, durante 2 horas a 37 ºC. O cassete de resistência a estreptomicina e espectinomicina ( spec) foi isolado da digestão do vetor pHP45 por eletroeluição (item 3.5.1). A ligação entre o vetor linearizado e o spec foi feita com 480 ng e 900 ng, respectivamente, com 1 U de T4 DNA ligase (Invitrogen) em tampão fornecido pelo fabricante, na presença de ATP (0,5 mM). A reação de ligação foi feita à temperatura ambiente por 16 horas e foi utilizada para transformar E. coli DH5α, como descrito no item 3.4.3. A cultura foi semeada em meio LB ágar acrescido de ampicilina, espectinomicina, estreptomicina, X- gal e IPTG. Os clones tiveram os insertos confirmados através de digestão do DNA plasmidial com ApaI/PstI. Uma destas digestões foi utilizada para isolar o fragmento contendo os flanqueadores de cspC com o spec inserido entre eles ( cspC:: spec).
3.5.4 Isolamento de DNA com papel de cromatografia e ligação no vetor pNPTS138
A digestão acima foi submetida à eletroforese em gel de agarose 0,8% e o gel foi corado com brometo de etídeo. Logo abaixo da banda que se desejava eluir, o gel foi cortado e foi colocado um pedaço de papel de cromatografia DE-81 (Whatman International Ltd., Maidstone, Kent, Reino Unido), e a eletroforese prosseguiu por mais 10 minutos, a fim de reter o DNA no papel. O DNA foi eluído do papel por 16 horas em uma solução de NaCl 1 M, Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) e EDTA 1 mM.
A eluição foi purificada com o mesmo volume de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1) e tratada com clorofórmio/álcool isoamílico (24:1) para retirar o excesso de fenol. O DNA foi precipitado com etanol a -80 ºC por 1 hora e lavado com etanol 70%, seco e ressuspendido em 20 l de TE contendo RNAse A (20 g/ml).
Novecentos nanogramas do fragmento isolado foram utilizados em uma ligação com 200 ng do vetor pNPTS138 digerido com ApaI/PstI, da mesma forma que o descrito no item 3.5.3. A cultura foi semeada em meio LB ágar acrescido de canamicina, espectinomicina e estreptomicina. Os transformantes foram confirmados através de digestão de seus DNAs plasmidiais com ApaI/PstI e visualização em gel de agarose.
3.5.5 Transformação de E. coli S17-1 e conjugação com C. crescentus NA1000
A minipreparação de pNPTS138( cspC:: spec) foi inserida em células de S17- 1 por eletroporação, da mesma forma que no item 3.4.3, sendo semeadas em LB ágar acrescido de canamicina.
Células de C. crescentus NA1000 foram coletadas com alça de platina e semeadas em placas com meio PYE, incubando-se a 30 °C por 3 dias. As células de S17-1 transformadas foram misturadas a esta massa de células de NA1000, com o auxílio de uma alça de platina. A conjugação ocorreu durante 16 horas. Então, as células foram semeadas em placa PYE ágar contendo canamicina, espectinomicina, estreptomicina e ácido nalidíxico (o qual impede o crescimento de E. coli), e as placas foram incubadas a 30 ºC durante cinco dias.
3.5.6 Reação de PCR para detecção da primeira recombinação
Colônias obtidas da conjugação acima tiveram seu DNA cromossômico extraído conforme o item 3.4.1. Estas minipreparações foram digeridas com PstI e 3 l destas digestões foram utilizados como molde na reação de PCR. A reação foi feita com os oligonucleotídeos H3 e H4 (25 pmol de cada), 0,2 mM de uma mistura de dNTPs (Invitrogen), 1,25 U de Taq DNA Polimerase (Invitrogen), 1,5 mM de MgCl2, 5% de
dimetilsulfóxido e 1 X tampão de PCR fornecido com a enzima. As condições de PCR foram de 95 ºC por 5 minutos, seguidos de 35 ciclos de 95 ºC por 30 segundos, 70 °C por 30 segundos e 72 ºC por 3 minutos. Após os ciclos, a reação permaneceu a 72 ºC por 7 minutos e foi mantida a 4 ºC. Em seguida, as reações foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 1% em tampão de corrida TBE 1 X. O gel foi corado com brometo de etídeo.
PYE ágar contendo canamicina para selecionar aquelas que fossem sensíveis ao antibiótico.
Um recombinante sensível a canamicina teve seu DNA genômico extraído, digerido com PstI e analisado por PCR, juntamente com amostras de DNA genômico de NA1000 e de um primeiro recombinante. A reação foi realizada como no item anterior, com os oligonucleotídeos C1 e CSPC-F, 10% de dimetilsulfóxido e temperatura de anelamento de 68 ºC. A deleção no gene cspC também foi avaliada por Western blot (ver item 3.12).