Son yıllarda enerji sıkıntısından dolayı, Dünya’da ve Türkiye’de alternatif enerji kaynaklarına özellikle biyoyakıtlara olan ilginin önemli miktarda artması ile biyodizel üretiminde de önemli patlamalar olmuştur. Biyodizel üretiminde toplam üretimin kütlece %10’u atık gliserol olarak açığa çıkmaktadır. Biyodizel üreticileri üretim fazlası olan gliserolü, çevreye de zarar vermeden nasıl bertaraf edecekleri konusunda ciddi sıkıntı yaşamaktadırlar ve gliserol için ekolojik ve ekonomik bir çözüm beklemektedirler.Bu yaklaşımda, gliserol atığının ekonomik değeri olan bir kaynak haline dönüştürülmesi ile ciddi bir çevre problemine çözüm getirilerek bu atıktan elde edilen yan gelirle biyodizel üretim maliyetleri aşağı çekilebilecektir.
Hali hazırda ekonomik değeri düşük olan gliserolden katma değeri çok yüksek ve çevreyle dost bir biyopolimer hammaddesi olan 1,3-PDO’nun biyoteknolojik yöntemler ile üretimi gelecek vaad etmektedir. Çok yaygın ve geniş bir kullanım alanına sahip olan 1,3-PDO, hammadde olarak son 25 yılda kimya endüstrisinin en çok ilgi çeken moleküllerinden birisi olmuştur. Mürekkep üretiminden, tekstil endüstrisi için hammadde üretimine, medikal uygulamalara kadar birçok alanda kullanımı mevcuttur. Endüstriyel 1,3-PDO üretimi, yeni bir polyester tipi olan ve tekstil endüstrisinde önemli uygulama alanı bulan PTT’nin sentezinde gerekli önemli monomorlerden biri olmasından dolayı da ayrıca ilgi kazanmıştır (Németh and Sevella, 2008).
1,3-PDO üretiminin en önemli girdisi ve masrafı olan hammadde temininin direk atık maddeden gerçekleştirilmesi, daha çevreci ve ekonomik bir yaklaşımdır. Bununla birlikte gliserol biyodönüşümüne bağlı 1,3-PDO, geleneksel üretime göre enerji maliyetinde %40 ve gaz emisyonlarında %20’lik bir azalışa neden olmaktadır (DuPont, 2010).
Maksimum üretim verimlerine ulaşabilmek için mikroorganizmaya özgü olarak proses optimizasyonu oldukça gereklidir. Ucuz ve verimli yöntemler ile biyoteknolojik 1,3-PDO üretimi arayışında gün geçtikçe daha başarılı olunmaktadır. Ancak, 1,3-PDO yolağındaki engel nasıl aşılır sorusunun cevabı ne kolaydır ne de direk cevap verilebilirdir ve doğru olan birden çok yanıt ortaya çıkabilir. Hala, istenilen verime ulaşabilmek için gerçekleştirilmesi gereken çok araştırma vardır. Literatür incelendiğinde, yalnızca metabolizma ve biyoproses
mühendisliğinin birlikte gerçekleştirildiği çalışmalarda verimli ve ekonomik çözümlere ulaşılabilmiştir (Zhang et al., 2006; Tang et al., 2009).
Tez boyunca gerçekleştirilen biyoprosesler biyokimyasal bir yöntem olan proteomiks ile de birleşerek metabolizmaya daha ayrıntılı bir bakış gerçekleştirilebilmesini sağlamıştır. Böylece katma değeri yüksek bir ürün olan
1,3-PDO üretimindeki en önemli etmenler belirlenmeye çalışılmıştır.
C. butyricum 1,3-PDO üretimi için literatürde sıklıkla kullanılmış olsa da literatürde proteomik analizler için kullanımı hiç gerçekleştirilmemiştir, buna ek olarak çok az sayıda çalışmada 1,3-PDO üretimini protein düzeyinde anlayabilmek için diğer mikroorganizmalar ile çalışmalar yapılmıştır (Jin ve Lee, 2008, Gonzalez et al., 2013, Wang et al., 2003). Literatürdeki bu çalışmalarda oldukça fazla protein ve pek çok yolaktan bahsedilmiş olsa da (karbonhidrat metabolizması, protein sentezi, gliserol parçalanmasının indirgen ve yükseltgen basamakları vb.), bu tez çalışması 1,3-PDO üretimi sırasınca aynı anda kullanılan tüm yolaklardaki ana proteinlerin C. butyricum’da gösterildiği ilk çalışmadır. Ayrıca, bu çalışma sonucunda etanol (CBY_3753) ve bütirat (CBY_2919) üretim yolakları dışındaki yolaklardaki protein ifadelerinin yüksek gliserol konsantrasyonunda her iki büyüme fazında da azaldığı gösterilmiştir. Bununla birlikte varılan bir diğer sonuçta olası hidrojenazların (CBY_2300 ve CBY_3049) ve olası bir 3-hidroksibütiril-KoA dehidratazın (CBY_3041) yüksek gliserol konsantrasyonunda durağan fazda yukarı ayarlandıklarıdır. Ayrıca, yüksek gliserol konsantrasyonunun büyümeyi yavaşlattığı ve aynı molar 1,3-PDO verimlere ulaşılmasına rağmen metabolik yolaklarda yer alan proteinlerin ifadelerini azalttığı raporlanmıştır. Elde edilen bu veriler genetik mühendisliği kullanılarak 1,3-PDO üretimini arttırabilecek çalışmaların temelini oluşturma niteliğindedir. Metabolik yolaklardaki hız belirleyici basamaklar bulunarak genetik değişiklikleri ile suş gelişimi proteomiksin kullanıldığı en önemli ve başarılı yaklaşımlardan biridir (McConkey, 2011). Örneğin, C. butyricum DSM 5431’de gliserol dehidrataz hız belirleyici basamak olarak bulunmuş ve ortamda NADH’in varlığına bağlı olarak bu enzimin aktivitesinin 1,3-PDO dehidrojenaz aktivitesini de sınırlandırdığı böylece üretimlerini düşük olduğu belirlenmiştir (Abbad-Andaloussi et al., 1996). Bu çalışmada da yüksek gliserol konsantrasyonunda olası bir gliserol dehidrataz (CBY_0502) C. butyricum’un proteomunda daha düşük seviyede ifade edilirken olası bir 1,3-PDO dehidrojenaz (CBY_0500) da aşağı ayarlanmıştır. Dolayısıyla, bu gen (CBY_0502) 1,3-PDO üretimlerini arttırabilmek için genetik manipülasyonlarda kullanılabilir. Hatta, bu genetik değişikliklerin sonuçları da proteomik analizler ile takip edilerek kontrol
edilebilir. –omiks teknolojierinin (genomiks, proteomiks, transkriptomiks, metabolomiks) hepsini birlikte kullanarak metabolik yolaklardan ve redoks dengelerinden ayrıntılı bilgiler elde edilebilir. Böylece, üretimler istenilen yöne kaydırılabilir ve yüksek 1,3-PDO üretilirken düşük yan ürünler üretilebilir. Ancak bu noktada üretimin geneline bakmak çok önemlidir, çünkü, bazı yolakların kapatılması hücrenin enerji üretimlerini de kısıtlayabileceğinden hücre ölümlerine ya da kararlılık problemlerine yol açabilir. Örneğin, mikrobiyal büyüme bütirat yolağının bloklanması ile etkilenmeyebilirken, üretilen ATP miktarı düşünüldüğünde asetat yolağının kapatılması ile çok yüksek olasılıkla büyüme etkilenecektir. Bu yüzden, genetik mühendisliği çalışmalarında bu sonuçlar kullanılırken hücrelerin protein seviyeleri ve bunlara karşı verdikleri fizyolojik tepkiler birlikte değerlendirilmelidir.
Ekonomik ve çevresel sebepler düşünüldüğünde substrat seçimi biyoteknolojik proseslerde en önemli problemlerden biridir ve çoğunlukla atık hammadde kullanılması gündeme gelmektedir. Buna ek olarak, ürün saflaştırılmasının yüksek maliyeti sebebi ile yüksek konsantrasyonda son ürün üretilebilmesi önem arz etmektedir. Bunu başarabilmek için 1,3-PDO üretimi sırasında C. butyricum için bütirat, laktat ve asetat; K. pneumoniae için ise asetat, laktat ve etanol üretimleri minimuma indirilmelidir. Bu sebeple, elde edilen proteomik analiz sonuçları farklı gliserol konsantrasyonlarında hücrelerin hangi fazlarda nasıl tepkiler verdiğini göstermekte ve buna bağlı olarak proses optimizasyonuna yardımcı olabilmektedir. Sonraki çalışmalarda hücrelerin immobilize olduklarında protein düzeyindeki farklılıkları değerlendirilerek hali hazırda yüksek konsantrasyonda ürün elde eldesi sağlanmış bir proses yöntemi ile çok daha iyi sonuçlar alınmasına katkıda bulunabilecektir. Sonuç olarak proteomiksin biyoproseslere entegre edilmesi ile hedeflenen düşük maliyetli alt akım işlemlerine ulaşılabilecek ve 1,3-PDO üretimi yüksek verimlilikte ve düşük hacimde reaktörlerde en iyi şekilde gerçekleştirilebilecektir.