foi descrita tanto no meio ambiente natural como em ambientes hospitalares (Falkinham, 2007). Vários trabalhos têm mostrado a formação de biofilmes de micobactérias em diferentes suportes (Vess et al., 1993; Falkinham et al., 2007;
Esteban et al., 2008) e sistemas de água (Brown-Elliot et al., 2002; Falkinham et al.,
2007). As espécies de MCR mais comumente incluídas em publicações referentes à formação de biofilmes são M. fortuitum, M. marinum, M. avium, M. smegmatis, e
mais recentemente M. abscessus (Recht & Kolter, 2001; Bardouniotis et al., 2003;
Falkinham, 2007; Esteban et al., 2008). As espécies M. massiliense e M. bolletii, por
terem sido descritas recentemente, nunca foram estudadas com relação à formação de biofilmes.
No presente estudo foram avaliadas as etapas de adesão e crescimento em biofilme além de outras análises paralelas (característica de deslizamento em meio semissólido, expressão de GPL e polissacarídeos de parede) com o objetivo de comparar as cepas de fenótipo L com as de fenótipo R e ainda cepas de surtos com as não relacionadas a qualquer surto e as de fontes ambientais.
Em 1962 Fregnan e Smith descreveram a morfologia de colônias de micobactérias, especialmente as MCR. Desde então, vários autores expandiram esses estudos de morfologia e os relacionaram com a expressão de GPL na parede celular micobacteriana (Jones & Kubica, 1965; Barrow & Brennam, 1982; Belisle & Brennan, 1989; Eckstein et al., 2000). Muitos estudos também relacionaram a
morfologia de colônias à virulência da cepa, com variantes R sendo, geralmente, mais virulentas do que as variantes L (Belisle & Brennan, 1989; Collins & Cunningham, 1981; Howard et al., 2006). Em nosso estudo, a escolha das cepas foi
realizada com base nos critérios de fenótipo de colônias e se eram isoladas de fontes ambientais, ou surto, ou ainda cepas clínicas não relacionadas a surtos. A comparação entre as cepas de surtos e outras fontes e cepas R e L foi baseada em experimentos publicados anteriormente, por outros autores que utilizaram MCR como modelo (Hall-Stoodley & Lappin-Scott, 1998; Martínez, 1999; Bardouniotis et al., 2003; Ojha et al., 2005, Howard et al., 2006; Esteban et al., 2008).
Com os resultados obtidos no ensaio de adesão a diferentes suportes abióticos não pudemos confirmar nossa hipótese de que a cepa do surto em cirurgias aderisse melhor a superfícies, em especial ao plástico que foi utilizado para imersão dos equipamentos usados nas cirurgias. Este comportamento poderia ser
um diferencial da cepa causadora do surto em cirurgias, mas não pode ser confirmado com o isolado 461 (do surto) em comparação aos isolados da mesma espécie 538 (abscesso pós-injeção) e MG3-6 (cepa ambiental de esgoto tratado) e com uma cepa de M. fortuitum que já havia sido utilizada em nosso laboratório em
um projeto anterior sobre biofilmes (projeto de Iniciação Científica de Camila Miwa Fujikawa – CNPq-PIBIC 2008-2009). Também não foi possível evidenciar diferenças quando colônias de fenótipo L e R da cepa 461 foram comparadas. Em seu artigo, Recht et al. (2000) demonstraram que uma cepa mutante de M. smegmatis, que teve
o seu fenótipo alterado para um fenótipo intermediário de L e R (parcialmente R), também demonstrou uma capacidade fraca de formar biofilmes, se comparada à cepa tipo que foi utilizada. Este resultado obtido por Recht et al. (2000) é diferente
do encontrado em nosso estudo, sugerindo que em diferentes espécies esse comportamento pode ser diverso. Além disso, a cepa do surto não aderiu mais ao plástico na presença de glutaraldeído 2% em comparação com os outros isolados analisados, apesar de já ter sido demonstrado que a cepa do surto tem tolerância aumentada a este desinfetante (Duarte et al., 2009)
O tempo de incubação de 6 horas, que foi utilizado no experimento de adesão foi baseado no artigo publicado em 2007 por Falkinham, no qual foram avaliados a adesão, o crescimento e a suscetibilidade a antimicrobianos de cepas de M. avium
crescidas em biofilmes. Os resultados obtidos por Falkinham (2007) demonstraram que neste tempo (6 horas) M. avium foi capaz de aderir na superfície do cateter. Em
nosso estudo, as cepas de M. massiliense se aderiram aos suportes utilizados, não
sendo possível evidenciar diferenças na adesão das cepas utilizadas, neste tempo de incubação.
Para acompanhar o crescimento bacteriano e tentar observar o crescimento em biofilmes nestas soluções, foram feitas observações diárias em microscópio. As observações realizadas com 6h de incubação, tempo usado para contagem de UFC do experimento de adesão, foram pobres para a observação de bactérias aderidas. Somente após alguns dias de incubação as bactérias puderam ser visualizadas em microscópio óptico. As bactérias visualizadas se aglomeravam geralmente na borda dos poços e lamínulas. No sétimo dia de observação, a estrutura das bactérias estava disforme, além de serem observados muitos debris. Foi observado visualmente que bactérias com fenótipo R tinham tendência a crescer menos e se aglomeravam mais que bactérias com fenótipo L.
Inicialmente, para obtermos curvas de crescimento, foram realizados ensaios nos quais o crescimento em biofilme foi verificado por contagem de UFC e leitura de absorbância (DO560nm). Os experimentos realizados não foram reprodutíveis. Não
era possível recuperar todas as bactérias aderidas, o que foi confirmado por observação ao microscópio das placas depois da retirada das bactérias. A grande quantidade de grumos formados por essas bactérias, especialmente as de fenótipo R, também pode ter influenciado na falta de reprodutibilidade das leituras de DO560nm
e contagem de UFC. Após esses primeiros resultados, que não foram mostrados aqui, foram feitas alterações, tanto no protocolo de obtenção do inóculo como na avaliação do crescimento bacteriano em biofilmes. Na etapa de obtenção do inóculo foram introduzidas etapas de passagem das bactérias repetidas vezes por seringa e sonicação, além da visualização das bactérias ao microscópio para assegurar sua dispersão antes de cada experimento. A avaliação do crescimento bacteriano passou a ser feita de maneira indireta, pela análise da redução da resazurina por leitura de absorbância (DO620nm). Este método permite avaliar o crescimento
bacteriano pela detecção de atividade metabólica e foi utilizado por von Groll (2010) com o objetivo de avaliar a cinética de crescimento de M. tuberculosis e comparar o
fitness de diferentes isolados.
Após a padronização da técnica para a utilização com cepas de M. massiliense, foram realizados vários ensaios com leitura de hora em hora
(totalizando um período de 15 horas) com o objetivo de visualizar o início da fase logarítmica de crescimento bacteriano. Estes ensaios, porém, foram pouco informativos porque era muito difícil fazer as medidas precisamente no início da fase logarítmica para todas as cepas do estudo. Após vários experimentos com diferentes tempos, foi estabelecido o tempo de 96h para este experimento, já que depois deste período o abundante crescimento bacteriano impedia a medida acurada de DO620nm.
As curvas de absorbância obtidas para cada cepa geraram as informações para o cálculo da velocidade de crescimento dessas bactérias. O objetivo principal de calcular a velocidade de crescimento estabelecendo um valor numérico para cada cepa foi o de comparar se essas velocidades eram diferentes para as cepas de surto e não surto. Os resultados não indicaram diferenças significativas. Por um lado, as velocidades de crescimento em biofilme das cepas do surto em cirurgias, que pertencem a um único clone, tiveram uma variabilidade grande, sendo que o crescimento de algumas dessas cepas se igualou, estatisticamente, ao crescimento
em biofilme de cepas não relacionadas a surtos. Quando as outras três cepas de surtos (5657 de M. bolletii, 33004 de M. abscessus e 32023 de M. fortuitum) foram
incluídas junto com as cepas do surto em cirurgias, também não foi possível estabelecer diferenças significativas entre as velocidades de crescimento de cepas de surtos e cepas não relacionadas a surtos (dados não mostrados). Esses resultados podem indicar que a técnica utilizada não é adequada para comparar tempos de crescimento muito próximos, e por isso, quando foi aplicado um teste estatístico, não houve diferenças significativas na comparação dos tempos de crescimento. É conhecido que quando bactérias passam por um mesmo conjunto de experiências biológicas, a diversidade de algumas características que estão sendo expressas no ambiente em que elas se encontravam diminui, sendo assim, os cultivos consecutivos que foram feitos em laboratório podem ter contribuído para uniformizar o tempo de crescimento destas bactérias, impedindo a observação de diferenças entre elas.
Para todas as cepas utilizadas neste estudo, foi obtida uma curva de crescimento sigmóide, que também foi observada no estudo realizado por Esteban
et al. (2008) para diferentes espécies de MCR. No mesmo trabalho, Esteban et al.
(2008) demonstrou que diferentes espécies de micobactérias foram capazes de desenvolver biofilmes em diferentes meios, sendo que houve diferenças na formação de biofilmes nos diferentes meios testados. Também já havia sido descrito por Hall-Stoodley (1998) que baixas condições de nutrientes diminuem o desenvolvimento de biofilmes de M. fortuitum e M. chelonae. É conhecido que MCR
são frequentemente isoladas de água, sendo as espécies mais frequentes M. chelonae, M. fortuitum, M. gordonae, M. kansasii e M. xenopi (Vaerewijck et al.,
2005).
Bardouniotis e colaboradores (2001; 2003) demonstraram por microscopia eletrônica (SEM) a presença de uma EPS associada a biofilmes das espécies M. phlei (Bardouniotis et al, 2001), M. fortuitum e M. marinum (Bardouniotis et al, 2003).
Imagens de microscopia eletrônica, utilizando FESEM, foram realizadas com a intenção de mostrar o aspecto desses biofilmes e a possível presença de EPS. Este equipamento foi escolhido, pois a resolução e qualidade das imagens são superiores em relação à SEM convencional. Na microscopia eletrônica os fixadores mais utilizados são o formaldeído, o glutaraldeído e o tetróxido de ósmio. O glutaraldeído forma ligações cruzadas entre as proteínas por possuir dois grupamentos aldeídos
em sua molécula, sendo um fixador que penetra mais lentamente nas amostras, formando ligações irreversíveis (De Souza et al., 1989). O formaldeído apesar de ser
um fixador clássico utilizado em microscopia ótica é muito empregado quando se deseja preservar a integridade bioquímica e antigênica das células, sendo um aldeído simples não forma ligações cruzadas, não conferindo uma preservação tão boa do material, contudo possui penetração mais rápida que o glutaraldeído (De Souza et al., 1989). Assim, desde a década de 60, Karnovisky (1965) propôs a
combinação do glutaraldeído e formaldeído como solução fixadora, a qual foi modificada e desde então é rotineiramente usada por pesquisadores no processamento de amostras para microscopia eletrônica, conferindo à amostra uma melhor preservação. O tetróxido de ósmio é utilizado numa segunda fixação (pós- fixação) e é excelente fixador para lipídios. Sendo o ósmio um metal pesado, também confere certo contraste às membranas. Para a microscopia de varredura a impregnação com ósmio precisa ser apenas superficial, pois nesse caso o objetivo do emprego do ósmio é aumentar a condutividade e emissão de elétrons secundários da amostra (De Souza et al., 1989).
Inicialmente, as amostras foram preparadas utilizando uma solução fixadora contendo apenas glutaraldeído 2,5% em tampão cacodilato 0,1M. As amostras foram pós-fixadas com tetróxido de ósmio 1% e tratadas com ácido tânico 1%. Os resultados obtidos (imagens não mostradas) mostraram bacilos de M. massiliense, M. fortuitum e M. smegmatis disformes (morfologia não preservada) e envoltos em
material extracelular de origem desconhecida. Não sabemos se este material foi secretado pelas bactérias ou se seria um artefato do processamento das amostras. Para descartar essa possibilidade um novo protocolo foi testado utilizando na fixação, uma solução de Karnovsky modificada contendo glutaraldeído, formaldeído, sacarose, cloreto de magnésio e cloreto de cálcio, sendo que não foi realizada a pós-fixação com ósmio e o tratamento com ácido tânico (ver métodos, item 3.4). A sacarose, o cloreto de magnésio e o cloreto de cálcio contribuem para manutenção da osmolaridade da solução. Com esse protocolo, que preserva melhor as estruturas celulares, obtivemos resultados mais satisfatórios no aspecto ultraestrutural dos bacilos. Estes formaram aglomerados e apresentaram a morfologia preservada, contudo, diferente dos resultados obtidos inicialmente, não foi observada a presença de material extracelular. Com essas informações podemos sugerir que o material observado inicialmente possa ser um artefato produzido pela metodologia utilizada,
possivelmente essas bactérias apenas se agrupem para formar um biofilme sem, contudo, produzir uma EPS verdadeira.
Biofilmes são comumente definidos como comunidades de microorganismos associados a uma superfície, biótica ou não, tipicamente envolvidos por uma EPS (Monds & O’Toole, 2009). A EPS é primariamente constituída por polissacarídeos, mas dependendo do ambiente em que o biofilme se desenvolve a EPS também pode ser constituída por proteínas, ácidos nucléicos e outras substâncias excretadas pelos organismos que compõem o biofilme (Davey & O’ Toole, 2000; Donlan, 2002; Zambrano & Kolter, 2005). As funções da EPS são essencialmente de proteção do meio externo, barreira para difusão de biocidas convencionais e antimicrobianos e ela pode ter importância no mecanismo de adesão bacteriana (Taveira & Nascimento, 2001).
Zogaj e colaboradores (2003) utilizaram o corante vermelho Congo para observar a produção de celulose na matriz extracelular produzida nos biofilmes de membros da família Enterobacteriaceae. Com o intuito de detectar a produção de
uma possível matriz extracelular polissacarídica ou lipídica, pelas micobactérias utilizadas neste estudo, utilizamos o mesmo princípio do trabalho de Zogaj. Os resultados obtidos pela observação visual das colônias crescidas em meio sólido não mostraram diferenças de intensidade de coloração na comparação de colônias de fenótipo R e L. Diferentemente, Etienne e colaboradores (2002) demonstraram que a variante isogênica rugosa (TM99) da cepa mc2155 se associou mais ao corante vermelho de Congo do que a cepa mc2155, de fenótipo liso.
O deslizamento sobre superfícies parece ter um papel na colonização por M. smegmatis (Martinez et al., 1999; Recht et al., 2000) e este processo é dependente
da expressão de GPL (Recht et al., 2000). Recht & Kolter (2001) afirmaram que há
uma correlação positiva entre a presença de GPL na superfície de M. smegmatis e a
morfologia das colônias, o deslizamento em superfície e a formação de biofilmes. Estes autores observaram que M. smegmatis com fenótipo R não desliza sobre meio
semissólido e não forma biofilmes, mas o fenótipo L dessa mesma espécie desliza sobre a superfície do meio semissólido e é capaz de formar biofilmes. Nossos resultados mostraram que cepas de fenótipo L expressam GPL na sua parede, enquanto que cepas de fenótipo R não mostraram expressão de GPL detectável pelo método de análise utilizado (TLC). Mas com relação ao experimento de deslizamento, foi observado que cepas de fenótipo R e L produziram halos de
tamanho semelhante. A exceção foi M. smegmatis, que desde o início da
observação deslizou mais, formando um halo de diâmetro significativamente maior que os halos produzidos pelas outras cepas, da espécie M. massiliense. Nossos
resultados não foram concordantes com os resultados já descritos para a espécie M. smegmatis (Recht & Kolter, 2000), já que as cepas de fenótipo R não apresentaram
perfil detectável de ácidos micólicos em sua parede mas foram capazes de deslizar em superfícies e formar biofilmes.
Com todas as abordagens utilizadas não foi possível detectar diferenças das bactérias de surto que justificassem sua seleção ao invés de outras espécies mais frequentemente isoladas do meio ambiente. Podemos sugerir, então, que houve uma pré-seleção deste único clone encontrado neste surto que acometeu vários estados brasileiros. Com esses resultados obtidos também pudemos constatar que não são fatores isolados que permitem diferenciar cepas de surto e não surto, mas sim um conjunto de fatores que ainda precisam ser identificados e melhor estudados.
6. CONCLUSÃO