Daldırmalı Kültür Tekniğ

Daldırmalı fermantasyon, sıvı ortamda tamamen çözünmüş yada katı süspansiyon halindeki nütrientleri kullanan, süspanse haldeki mikroorganizmaların gelişmesiyle oluşur. Bu yöntemde mikroorganizma besiyerinin içerisinde geliştirilir. Gerekli hava substratın yüzeyi üstünde bulunur veya havalandırma düzeni yardımıyla substrat içerisine verilir.

En basit daldırma metodu, aşılanmış sıvı kültürünün çalkalanmasıdır. Bunun için dairesel veya yatay hareketler yapan çalkalayıcılara yerleştirilen erlenler, istenilen hız, süre ve sıcaklıkta çalkalanır. Daha büyük hacimde çalışmalar için daldırma biyoreaktörleri kullanılır. Daldırmalı fermantasyon için bir çok bioreaktör sistemi vardır.

1) Mekanik karıştırmalı sistemler 2) Konveksiyon akımlı sistemler 3) Kabarcık kolon sistemler 4) Pnömatik çalışan sistemler

Mevcut sistemlerin çeşitliliğine rağmen pratikte ağırlıklı olarak 1. türden karıştırmalı reaktörler kullanılır.

Bu yöntemde uygun büyüklükteki karıştırmalı bir tanka gerekli bileşimde hazırlanan hammaddeler beslenir. İstenilen pH’ya ayarlanan besleme sürekli Yüksek Sıcaklık Kısa Süre (High Temperature Short Time-HTST) sterilizasyon birimi yardımıyla daha önceden buharla sterilize edilmiş fermentör kaplarına pompalanır. Gerekirse, köpük kırıcı maddeler, viskozite ve çözünebilirliğini ayarlayan bazı maddeler steril ortama ayrıca ilave edilir [9]. Diğer koldan mikroorganizma, fermantöre gelmeden önce birkaç aşı hazırlama safhasından geçer. Kullanılan tanklar fermantasyon ortamının korozif özelliklerine uygun bir paslanmaz çelikten geniş bir basınç aralığında (tipik olarak vakumdan 20 kPa basıncına kadar) çalışacak şekilde dizayn edilir. Proseste, aerobik mikroorganizmalar kullanılırsa, fermantasyon ortamına steril hava verilmesi gerekir. Ayrıca oksijenin gaz fazdan sıvı faza transferi için ortamın karıştırılması gerekmektedir. Verilen hava içerisindeki mikrobiyal hücrelerin uzaklaştırılmasında endüstride kullanılan temel iki prosesten birincisi, hidrofobik silikon esaslı membran filtreler kullanarak yapılır, diğeri ise ısıyla ön sterilize edilebilen lifli maddeleri içeren derin filtreler kullanılarak yapılır [8]. Sterilize edilen hava fermantasyon ortamına tek veya çok girişli dağıtıcı bir sistem yardımıyla verilir. Karıştırma ise dikey olarak dönen bir şaft üzerine bindirilmiş çok bıçaklı disk türbinlerle yapılır.

Aerobik mikrobiyal büyüme ekzotermik bir prosestir ve ısı üretir. Havalandırma ve karıştırma prosesleriyle ısı dağılımına ilave olarak fermantasyon sıcaklığını 30-35 C’de tutmak için ortamdan ısı uzaklaştırılmalıdır. Bakteriyel fermantasyonda daha fazla metabolik ısı üretilmektedir ve bu bazı durumlarda diğer organizmalar için olan değerin iki katı olabilir. Büyümenin ve metabolit üretiminin kontrol altında tutularak sürekli bir ürün eldesi için çeşitli parametreler hem aşı geliştirme hem de fermantasyon ile ürün üretim aşamasında dikkatlice incelenmelidir. Fermantasyon ortamının sıcaklığını, soğutma suyunun sıcaklığını, sıvı hacmini, karıştırıcı hızını, gücünü veya torkunu, hava ve sıvı besleme hızını kültür ortamındaki köpük varlığı gibi fiziksel parametreleri izlemek için çeşitli cihazlar kullanılır.

Fermantasyon kesikli, yarı kesikli ve sürekli kültivasyon metotlarından biriyle yapılabilir. Kesikli kültür fermantasyonda başlangıçta gerekli olan tüm bileşenler (nütrientler ve hücreler) fermantöre ilave edilir. Kültür ortamında büyüme ilerledikçe nütrientler harcanır mikrobiyal kütle artar. Bir kesikli fermantasyon için gerekli zaman, sağlanacak çalışma koşullarına göre birkaç saatten birkaç haftaya kadar değişebilir. Bu süre sonunda fermantasyon ortamı bileşenleri çeşitli ayırma yöntemleri ile ayrılır. Ürün kazanımı amacıyla alt akım işlemleri (santrifüjleme, filtrasyon, diyaliz hücresi, vakum altında buharlaştırma vb.) uygulanır.

Kesikli fermantasyon, biyoteknolojik ürünlerin üretiminde tercih edilen bir metot olarak yaygın bir şekilde kullanılır. Bununla birlikte substrat tarafından katabolit represyon meydana geldiği zaman sınırlı karbon koşullarında çalışabilmek için alternatif olarak yarı kesikli fermantasyon kullanılabilir. Bu tür proseslerin esas özeliği, maksimum üretim periyodunu uzatmak için ilave nütrientlerin fermantasyon ortamına beslenmesidir. Yarı kesikli sistemlerde, yüksek substrat derişimli kesikli fermantasyona göre biyokütle üretimi azalmaktadır ve böylece kütle ve oksijen transfer mekanizmaları kolaylaşmaktadır.

Alternatif bir işletme şekli sürekli kültivasyondur. Burada sürekli olarak kültüre steril taze nütrient beslenirken aynı zamanda ortamdan eşit hacimde karışım fermantörden çekilir. Fermantörü terk eden biyokütle ile hücre büyümesi dengededir. Kemostat olarak adlandırılan sürekli kültür sisteminin en yaygın kullanılan tipi, ortam beslenmesini içeren bileşenlerden biri hariç tüm nütrientleri aşırı olacak şekilde besleme tasarlanır. Bu koşullar altında kararlı halde kültürün spesifik büyüme hızı, seyrelme oranı olarak adlandırılan besleme hacminin kültür hacmine oranı yardımı ile belirlenir. Kültürün biyokütle derişimi besleme ortamındaki sınırlayıcı komponentin derişimi tarafından belirlenir. Sürekli kültür,

klasik kesikli fermantasyon kültüründen daha yüksek verimlilik ve spesifik nutrientin sınırlandırılmasıyla represyon mekanizmalarının etkilerini hafifletebilmesine rağmen, ticari üretim proseslerinde oldukça sınırlı olarak kullanılmaktadır. Bunun sebebini dört başlık altında inceleyebiliriz.

a) Sürekli proseslerin uzun sürelerinden dolayı yabancı mikroorganizmaların

oluşmasıyla fermantasyon ortamının kontaminasyonu muhtemeldir. Kontaminasyon riski sürekli fermantörlerde karşılaşılan en büyük sorundur. Öyle ki kontaminant mikroorganizma tüm fermantöre hakim olabilir. Ticari öneme sahip çoğu ürün (özellikle sekonder metabolitler) mikroorganizma üremesi durduktan sonra yani durağan evrede elde edilir. Büyüme ürün üretimini baskılar ve bu şartlar altında sekonder metabolit üretimi için ideal sistemler kesikli olarak işletilen fermantasyon sistemleridir. Sekonder metabolitlerin üretiminde ürün hızı (productivity) kesikli olarak işletilen sistemlerde sürekli olarak işletilen sistemlere göre daha yüksektir.

b) Kesikli olarak işletilen fermantasyon sistemlerinin diğer bir avantajı ise

mikroorganizmaların genetik stabilitesidir. Çok uzun çalışma saatlerinde özellikle yirmi beşinci jenerasyondan sonra rekombinant mikroorganizmaların yapısal kararlılıkları bozulmaktadır.

c) Kesikli olarak işetilen fermantörler değişik amaçlar kapsamında değişik zaman

dilimlerinde kullanılabilirler.

d) Ticari metabolitlerin üretim proseslerinde yaygın olarak kullanılan kompleks

ortamlarda, büyümeyi sınırlayan nutrientlerin miktarlarının kesin olarak belirlenmesindeki güçlüklerdir.