Canine Parvovirus enfeksiyonundan şüpheli ya da gastroenteritis semptomu gösteren toplam 100 adet köpekten alınan dışkı örnekleri laboratuvara getirildikten sonra PCR, ELISA ve hızlı test uygulamalarında kullanılmak üzere porsiyonlanarak steril üç ayrı ependorf tüpüne konuldu. Dışkı numuneleri testlerde kullanılıncaya kadar -20 oC de saklandı.
2.3. Hızlı Test
Dışkı numunelerinde CPV antijenini tespit etmek amacıyla Biopronix- Agrolabo (İtalya) firmasına ait ticari hızlı test kiti kullanıldı.
Test kitinin içerisinde dışkı sulandırma sıvısı, damlalık ve test kaseti yer almaktadır. Ependorf tüplere paylaştırılan dışkı örnekleri, kite ait sulandırma sıvısı ile sulandırıldıktan sonra pipet yardımıyla alınıp test kitinde yer alan “S” yazılı kuyucuğa 3-4 damla kadar konuldu ve 5-10 dk beklendikten sonra oluşan çizgilere göre sonuç gözle okundu. Testin yorumlanması esnasında, kaset üzerindeki “C” yazılı bölümde tek bir çizginin oluşması kitin sağlıklı bir şekilde çalıştığını göstermekle birlikte test edilen dışkı örneğinin CPV antijeni yönünden negatif olduğunun bir göstergesi olarak kabul edilmiş, kasetin hem “C” hem de “T” yazılı bölümünde birer çizginin oluşması ise sonucun pozitif olduğunun değerlendirilmesinde kriter olarak kullanılmıştır.
30 2.4. ELISA
Bölüm 2.2.1’de belirtilen şekilde önceden hazırlanan dışkı örnekleri, CPV’ye spesifik antijenlerin varlığı yönünden ticari olarak temin edilen direkt ELISA (Biopronix – Agrolabo, İtalya) kiti ile incelendi.
ELISA Kitinin İçeriği
Antikor ile kaplı 96 kuyucuklu mikropleyt, Negatif kontrol, Pozitif kontrol, Konjugat I, Konjugat II, Substrat, Stop solüsyonu, 25x Yıkama solüsyonu ve
Sulandırma solüsyonları içermektedir ELISA Testinin Uygulanması
Soğuk zincirde muhafaza edilen dışkı örneklerinin ve ELISA kitinin uygulamaya başlamadan 1 saat önce oda ısısına gelmesi sağlandı.
1/100 oranında sample ve konjugat-I diluent ile sulandırılarak hazırlanan pozitif (PK) ve negatif (NK) kontroller 100 µl olarak sırasıyla pleytin A1 ve B1 kuyucuklarına konuldu.
Diğer kuyucuklara (C1, D1, E1 ……, vb) sulandırılan (1 gr dışkı 2 ml sample ve konjugat-I diluent ile karıştırılıp santrifüj edildikten sonra elde edilen supernatant) dışkı örneklerinden 100 µl ilave edildi.
1 saat 37 oC’de inkubasyona bırakıldı. Hazırlanan yıkama solüsyonu ile 4 kez
kuyucuklar yıkandı.
Tüm kuyucuklara 1/100 oranında hazırlanan konjugat-I’den 100’er µl ilave edildi. 1 saat 37 oC’de inkubasyona bırakıldı.
4 kez yıkama işlemi gerçekleştirildi. Tüm kuyucuklara 1/100 oranında hazırlanan konjugat-II’den 100’er µl ilave edildi.
31 15 dk oda ısısında inkübe edildi. 4 kez yıkama işlemi gerçekleştirildi. Tüm kuyucuklara substrat buffer ile 10 katlı sulandırılan substrattan 100’er µl ilave edildi ve 10 dk oda ısısında inkübe edildi.
İnkübasyon süresi sonunda tüm kuyucuklara, boşaltılmadan, 100 µl stop solüsyonu ilave edilerek reaksiyon durduruldu.
Mikropleytler sonuçlar değerlendirmek üzere ELISA okuyucusuna yerleştirildi. Testin Değerlendirilmesi
Sonuçlar ELISA okuyucusunda (Rayta RT-2100C, Çin) 405 nm dalga boyunda okutularak Optik Dansite (OD) değerleri belirlendi ve sonuçlar kit prosedürüne göre değerlendirildi.
Sonuçların Değerlendirilmesi
Kontroller kullanılarak testin “Cut Off” değeri hesaplandı; Cut Off = ODPK × 0.2
Cut Off = ODNK × 0.2
Pozitif Örnek = Sample OD > PK Cut Off Negatif Örnek = Sample OD > NK Cut Off 2.5. Dışkı Örneklerinden DNA Ekstraksiyonu
Ekstraksiyon işlemleri pozitif kontrol (CPV-2) ile birlikte yürütüldü. Toplanan dışkı örneklerinden ‘QIAamp DNA Stool Mini Kit’ (QIAGEN, 51504, Almanya) kullanılarak viral DNA ekstraksiyonu yapıldı. Bu amaçla;
180-220 mg kadar dışkı örneği 2ml’lik steril santrifüj tüpüne aktarıldı,
Herbir dışkı örneğinin üzerine 1.4 ml ASL buffer ilave edildi. Daha sonra dışkı örnekleri homojen dağılımın gerçekleşmesi için 1 dk boyunca vortekslendi.
Süspansiyonlar 70 oC de 5dk ısıtıldı.
Örnekler 15 saniye vortekslendikten sonra 1dk maksimum hızda (20.000 x g/ 14.000 rpm) santrifüj edildi.
2 ml’lik yeni santrifüj tüplerine 1.2 ml miktarında süpernatant alındı. Geriye kalan dışkı peletleri atıldı.
Herbir örneğe 1 adet inhibitEx tablet ilave edildi ve hemen anında 1dk boyunca ya da tablet tamamen eriyene kadar vorteksleme işlemine devam edildi.
32 İnhibitörlerin inhibitEx matrikse adsorbe olabilmesi için, süspansiyon 1dk boyunca inkübasyona bırakıldı.
Örnekler maksimum hızda 3 dk santrifüj edildi, (matrikse bağlanmış inhibitörleri çöktürmek için).
1.5 ml’lik yeni steril santrifüj tüplerinin içine süpernatantlar alındı ve peletler atıldı. Yeni tüplere alınan süpernatantlar maksimum hızda 3 dk santrifüj edildi. Yeni 1.5 ml’lik tüplerin içine 15µl proteinase K ilave edildi.
Proteinase K ilave ettiğimiz 1.5 ml’lik tüplere elde ettiğimiz supernatantlardan 200 µl eklendi.
200 µl AL buffer ilave edip 15 saniye vortekslendi. 70 oC de 10 dk inkübasyona bırakıldı.
Lizata 200 µl ethanol (%96-100) ilave edildi ve vortekslendi.
2ml’lik steril toplama tüplerine yerleştirilmiş spin collum tüpünün kapakları etiketlendi. Son adımda elde edilen lizat spin colluma dikkatlice konuldu. Kapak kapatılarak maksimum hızda 1 dk santrifüj yapıldı. Sonra spin collum tüpü yeni bir 2 ml’lik toplama tüpüne yerleştirildi. Eski toplama tüpü atıldı.
Spin collumun kapağı açılarak 500 µl buffer AW1 ilave edildi. Kapak kapatılarak maksimum hızda 1 dk santrifüj yapıldı. Daha sonra spin collum yeni bir toplama tüpüne yerleştirildi. Eski toplama tüpü atıldı.
Spin collumun kapağı dikkatlice açılarak 500 µl buffer AW2 ilave edildi, kapak kapatılarak maksimum hızda 3 dk santrifüj yapıldı. Toplama tüpü filtrat ile birlikte atıldı.
Spin collum yeni bir 2 ml’lik toplama tüpüne yerleştirildi. Yeni toplama tüpüne yerleştirilen spin collumu maksimum hızda 1 dk santrifüj edildi.
Spin collum etiketlenmiş yeni 1,5 ml lik mikrosantrifüj tüpüne transfer edildi. Spin collumun kapağı dikkatlice açılarak içerisine 200 µl Buffer AE’i doğrudan QIAamp membranın üzerine ilave edildi. Kapağı kapatıp 1 dk oda ısısında inkübe ettikten sonra DNA elüsyonu için maksimum hızda 1 dk santrifüj edildi.
Ekstraksiyon işlemi sonucunda elde edilen DNA ekstraksiyon ürünleri PCR’da kullanılıncaya kadar -20 oC’de muhafaza edildi.
33 2.6. PCR Uygulaması
Ekstraksiyonu yapılan örneklerden elde edilen viral DNA ürünleri ticari PCR kiti (Taq PCR Master Mix – QIAGEN, Almanya) kullanılarak incelendi.
İçerisinde master mix ve RNAse free su bulunan kit, kullanılıncaya kadar -20 oC’lik derin dondurucuda muhafaza edildi. Araştırmada kullanılan primerler Çizelge 2.1.’de belirtildi.
Çizelge 2.1. CPV-2ab’ye yönelik olarak kullanılan primer çifti dizilimi (Nandi ve ark 2010).
Primer Sekans (5' - 3') Primer Genom
Pozisyonu
Ürün Boyutu CPV-2ab (Forward) GAA GAG TGG TTG TAA ATA ATT
3025-3706 681bp CPV-2ab (Reverse) CCT ATA TAA CCA AAG TTA GTA
Kit içerisinde bulunan Taq master mix ve RFW çözdürüldü. Kitin içerisinde belirtildiği gibi 10x 2µM lık primer çözeltisi hazırlandı. Herbir örnek için toplam miktar 100 µl olacak şekilde; DNA ürünü, hazırlanan primer çözelti, master mix solüsyonu ve RFW içeren ürün hazırlandı. Bu ürünler termal cycler (Bio-Rad T100, Singapur) içerisine yerleştirildi.
Termal cycler’daki PCR aşamaları ve bu aşamalar sırasında uygulanan derece (oC)/ süre değerleri Çizelge 2.2.’de belirtilen şekilde gerçekleştirildi.
Çizelge 2.2. PCR aşamaları ve bu aşamalar sırasında uygulanan derece (oC)/
süre değerleri.
ADIM ZAMAN ISI
1. Başlangıç Denatürasyonu 3 dakika 94 oC
2. Denatürasyon 45 saniye 94 oC
3. Annealing (bağlanma) 45 saniye 50 oC
4. Extension (uzatma) 1 dakika 72 oC
5. Final Extension (son uzatma) 10 dakika 72 oC
34 2.7. PCR Ürünlerinin Elektroforezi
Her bir PCR ürününün değerlendirilmesi için elektroforez tekniğinden yararlanıldı. Bu amaçla, %1.5’luk agaroz (Sigma, Almanya) 0,5xTAE (Tris Asetat – Ethylene Diamine Tetra Acetic Asid) tamponunun içerisine karıştırılarak mikrodalga fırında eritildi. 65–70 °C’ye kadar soğutulduktan sonra agarose jel içine 100 ml için 10 μl olacak şekilde Ethidium Bromide (EtBr-Sigma, Almanya) ilave edildi. Agaroz jel yatağı elektroforez tankına (Serva Electrophoresis GmBH, Heidelberg, Carl-Benz, Blue Marine 100, Almanya) yerleştirildi. Pozitif ve negatif kontrol dahil olmak üzere PCR ürünlerinin de (7 μl) bulunduğu DNase ve RNase free eppendorf tüplerine gel loading solution (Sigma, Almanya)’dan 3 μl konularak pipete edildi. Agaroz jeldeki ilk kuyucuğa 10 μl, 100 base pair (bp)’lik DNA Ladder (Solis BioDyne 100 bp DNA Ladder, Tartu Estonia), 2. kuyucuğa 10 μl pozitif kontrol, 3. kuyucuğa 10 μl negatif kontrol (PCR ürünü yerine RFW eklenerek hazırlandı) ve takiben sırasıyla PCR ürünlerinden 10’ar μl konuldu.
Elektroforez tankının kapağı kapatılarak güç kaynağı (Serva, Blue Power Plus, Almanya) 100 V ve 50 mA ayarlandı ve 60 dk jelde katot (–)’dan anot (+)’a doğru numuneler yürütüldü. Bu süre sonunda jel transilluminatör (UVP Inc., Upland CA, ABD) altında incelenerek PCR sonrasında gelişen bantlar (681 bp) değerlendirildi ve fotoğrafları kaydedildi.