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A análise da expressão de genes relacionados à captação de luz e fixação de carbono foi realizada para identificar diferenças moleculares associadas às taxas fotossintéticas. Entre todos os genes analisados, apenas uma proteína do centro de reação do fotossitema II (pspB), envolvida com a evolução de oxigênio (Bricker et al. 2012), e uma subunidade da Rubisco (Rbsc) foram menos expressas em S. spontaneum (Tabela 17), correlacionando com

a menor taxa fotossintética deste genótipo (Figura 9A). Entretanto, outros genes analisados não seguiram este padrão.

As enzimas piruvato ortofosfato diquinase (PPDK), anidrase carbônica (CA) e fosfoenol piruvato carboxilase (PEPC) catalisam reações sequenciais no início do ciclo C4. PPDK, utilizando piruvato e ATP como substrato, catalisa a formação de fosfoenolpiruvato (PEP), enquanto CA catalisa a hidratação de CO2 a HCO3- que, juntamente com o PEP, será substrato para a PEPC produzir oxalacetato. O perfil destes três genes foi similar nos genótipos, com S. officinarum e S. spontaneum apresentando os menores níveis de expressão (Tabela 17).

Tabela 17. Expressão gênica em folha. O sinal de referência é indicado por ++. Cada + significa uma diferença no valor de

expressão de 0,5 em relação à referência.

Categoria SAS Gene RB867515 S. officinarum S. robustum S. spontaneum

Captação de luz

SCJLLR1102C07.g Photosystem II reaction center

PsbP family protein ++ ++ +++ + SCJFLR1073E07.g Photosystem II 10 kDa

polypeptide ++ ++ +++ +++

Fixação de carbono

SCCCLR1001E04.g _{Rubisco small subunit (RbcS)} +++ ++ ++ + SCEQLB1063G04.g _{Carbonic anhydrase (AC)} ++++ ++ +++++ ++ SCJFRT1060F11.g Pyruvate phosphate dikinase

(PPDK) +++ ++ ++ ++ SCRULR1020D09.g Phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) ++++ ++ ++++ ++ Metabolismo de Sacarose SCCCLR1C06G07.g Sucrose-phosphate synthase (SPS) ++ ++++ ++++ ++

SCEPCL6023F02.g _{Sucrose synthase (SS)} ++ +++++ ++++ + SCJLLR2020E06.g Cytosolic fructose-1,6-

bisphosphatase ++ +++ ++++ +++

SCVPRT3086D06.g _Invertase ++ +++++++++++ + ++++++++ Transportador SCEQRT2028C04.g Aquaporin ++++++ + +++++++++++++ ++++++++++++

O perfil de expressão de aquaporinas, proteínas envolvidas no movimento de água e solutos entre células e compartimentos celulares, também foi analisado (Tabela 17). Claramente, há um padrão distinto entre as plantas de alto e baixo brix, sendo que S.

spontaneum e S. robustum apresentaram uma regulação positiva de duas aquaporinas em

folha. O mesmo foi observado para uma aquaporina em entrenó imaturo e maduro (Tabelas 13 e 15).

4.10. Construção de uma rede de coexpressão de genes de metabolismo de

lignina

Redes de coexpressão são ferramentas importantes para identificação de genes associados a determinados processos celulares. Essa análise se vale do conceito guilt-by-

association (Quackenbush 2003), no qual genes que desempenham funções em um mesmo

processo biológico tendem a ter padrão de expressão similar. Assim, é possível inferir uma função ou envolvimento num processo biológico a um gene não-caracterizado conforme sua expressão siga um padrão exibido por genes conhecidos. Essa análise já é muito utilizada para identificar envolvimento de genes em processos biológicos diversos em diferentes organismos, como mamíferos, insetos, levedura e plantas (Stuart et al. 2003; Lee et al. 2004; Ruprecht et al. 2011; Movahedi et al. 2012). Em plantas, já foi demonstrada a utilidade das redes de coexpressão para análise comparativa entre espécies através da integração da homologia e da expressão dos genes (Movahedi et al. 2012) e também para a identificação de genes envolvidos em diversos processos celulares, incluindo o metabolismo de parede celular (Ruprecht et al. 2011; Ruprecht & Persson 2012; Wang et al. 2012).

Como abordado na introdução, o conhecimento do metabolismo de parede celular de gramíneas ainda está muito aquém do que se sabe para outras plantas e a identificação de novos genes de gramíneas envolvidos nesse processo irá ajudar no avanço desse conhecimento. Assim, com base no conceito guilt-by-association, para identificar genes desconhecidos e fatores de transcrição candidatos à participantes do metabolismo de parede celular foi gerada uma rede de coe p ess oàdeàge esàutiliza doà o oà is a ào gene da via de fenilpropanoides 4CL (SCCCCL3002A03.b), o qual foi identificado com padrão de expressão diferencial nos clusters de genes de parede celular (Figuras 24 e 27) e nos experimentos de qPCR (Tabela 14). Entretanto, pela falta de ferramentas disponíveis que utilizem dados de expressão de cana-de-açúcar, as análises foram realizadas com dados de expressão de milho, a gramínea mais próxima de cana-de-açúcar que possuía a ferramenta disponível. Assim, a estratégia adotada foi utilizar o homólogo do SAS SCCCCL3002A03.b (4CL) de milho como isca com auxílio da ferramenta Genevestigator (Hruz et al. 2008) e identificar posteriormente os homólogos correspondentes de cana-de-açúcar da lista de genes coexpressos de milho (Figura 31 e Tabela 18). Essa ferramenta utiliza dados públicos de centenas de experimentos de microarranjo, em diversas condições diferentes, para analisar o padrão de expressão dos genes e calcular a correlação entre a expressão dos mesmos. Após a análise da lista de genes identificados, a validade dessa rede pode ser verificada pela identificação de vários genes de biossíntese de parede celular (PAL, COMT, CAD, CesA, glicosiltransferases, entre outros, Tabela 18), concordando com o a hipótese

guilt-by-association. Além dos genes já esperados, podemos destacar alguns genes

desconhecidos (Unknown) e fatores de transcrição (Platz, knotted-1-like e MYB) que também aparecem na rede, os quais podem ser genes de gramíneas envolvidos na biossíntese e regulação da parede celular. Vale ressaltar que o TF da família knotted-1-like

(SCEZLB1006E02.g) é o homólogo putativo do regulador da biossíntese de parede celular de Arabidopsis, KNAT7. TFs da família Platz são pouco conhecidos, mas sabe-se que são capazes de se ligarem em regiões ricas em AT (Nagano et al. 2001). Entre os SAS unknown, SCJLRT1015F06.g e SCCCCL4017H11.g possuem os domínios de função desconhecida DUF563 e DUF231, respectivamente. Ambos apresentam indícios de estar envolvido no metabolismo de parede celular pois DUF563 é encontrado em xilosiltransferases de

Trichomonas vaginalis (Hwa et al. 2012) e arroz (Chiniquy et al. 2012) enquanto DUF231 é

importante para a acetilação de xilanas (Yuan et al. 2013). Os demais SAS unknown (SCCCAM2001D03.g e SCSGST3118D04.g) não possuem nenhum domínio conhecido.

Figura 31. Rede de genes coexpressos com o gene 4CL de milho. Ponto central preto indica o gene

4CL e círculos concêntricos mostram os limites do coeficiente de correlação de Pearson até o cutoff de 0.8. Genes com correlação mútua acima de 0.8 estão conectados por linhas azuis.

Tabela 18. Lista de genes de milho coexpressos com o gene 4CL e seus respectivos homólogos de cana-de-açúcar. Os genes estão dispostos de forma decrescente pelo valor de coeficiente de

correlação. Os genes podem ser identificados na Figura 31 pela numeração da primeira coluna.

Nº Transcrito de milho Anotação Homólogo de cana

1 GRMZM2G000812 Sugar transporter SCJLRZ1021E01.g*

2 GRMZM2G074604 Phenylalanine ammonia-lyase (PAL) SCJFLR1017B11.g*

3 GRMZM2G150302 Glycosyltransferase GT43 SCCCRZ2C01D11.g*

3 GRMZM2G035584 Hydroxyanthranilate hydroxycinnamoyltransferase 2 SCCCCL4009E02.g 5 GRMZM5G844562 Cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) SCEPRZ1011A02.g 6 GRMZM2G029048 Phenylalanine ammonia-lyase (PAL) SCEQRT1024E12.g 7 Zm.1502.1.A1_at Caffeic acid 3-O-methyltransferase (COMT) SCRFLR1012F12.g* 8 GRMZM2G028104 3-N-debenzoyl-2-deoxytaxol N-benzoyltransferase SCJFRT2054E01.g

9 GRMZM2G019404 Plasma-membrane H+ATPase2 SCCCRT1002F07.g*

10 GRMZM2G094168 Platz transcription factor SCCCLR2C03B01.g

11 GRMZM2G127948 Caffeoyl-CoA O-methyltransferase (CCoAOMT) SCCCLR1069B09.g

12 Zm.8633.1.A1_x_at Glycosyltransferase GT43 SCCCRZ2C01D11.g*

13 GRMZM2G159759 GDSL-like Lipase/Acylhydrolase SCEPLB1044A08.g

14 GRMZM2G151519 ZIM motif family protein SCSFRT2072D04.g

15 GRMZM2G006894 Proton-exporting ATPase Fragment SCCCRT1002F07.g 16 GRMZM2G441347 Phenylalanine ammonia-lyase (PAL) SCJLRT1013C01.g

17 GRMZM2G159724 Malic enzyme SCCCCL2001A05.b*

18 GRMZM2G059845 Cell wall-related glycosyltransferase family 47 (GT47) SCSBHR1053F06.g

19 GRMZM2G122937 Remorin SCJFLR1013D11.g

20 Zm.118693 Probable peptide/nitrate transporter SCACLR1057B09.g* 21 GRMZM5G860590 Development and cell death domain SCEQLR1091B08.g 22 GRMZM2G132866 Beta-1,3-galactosyltransferase SCSGLR1045E04.g

23 Zm.38134 Unknown SCJLRT1015F06.g*

24 GRMZM2G125923 Prephenate dehydratase (phenylalanine biosynthesis) SCEQRT2093C02.g*

25 GRMZM5G862540 UDP-glucose dehydrogenase SCQGLR1019G02.g

26 GRMZM2G066165 Unknown SCCCCL4017H11.g

27 GRMZM2G068158 Putative methyltransferase SCRFLB1053H12.g*

28 GRMZM2G042818 3-hydroxyisobutyryl-CoA hydrolase/ catalytic SCBFLR1083F12.g

29 Zm.13519 Unknown nd

30 GRMZM2G007466 Protein tyrosine kinase SCRUSB1078B08.g

31 GRMZM2G444845 BAG domain (Chaperone activity) nd

32 GRMZM2G165357 TDP-glucose dehydratase SCCCRZ2001D09.g*

33 GRMZM2G141473 Aldehyde oxidase-2 SCCCCL4011A06.g

34 GRMZM2G424832 Cellulose synthase-4 SCCCLR1066B10.g*

35 GRMZM2G131205 Cinnamoyl CoA reductase (CCR) SCBFRT1064A01.g

36 GRMZM2G159431 Homeobox protein knotted-1-like (KNAT7) SCEZLB1006E02.g

37 GRMZM2G151516 Unknown SCSGST3118D04.g

38 GRMZM2G018241 Cellulose synthase-9 SCCCLR1065F07.g*

39 Zm.92707 Platz transcription factor SCCCLR1078B06.g*

40 GRMZM2G142898 Cellulose synthase catalytic subunit 12 SCCCLR2C02H01.g 41 GRMZM2G150187 GDSL-like Lipase/Acylhydrolase SCVPST1059E11.g

Um total de 46 genes dos 48 presentes na lista possuem algum homólogo ou gene com alta identidade em cana-de-açúcar sendo que 20 estão presentes no chip Agilent. Assim, da mesma forma conduzida na seção 4.8.3, foram gerados clusters hierárquicos com os dados de sinal de expressão desses genes para entrenó imaturo e intermediário para identificar os genes que possuem expressão diferencial entre nos genótipos ancestrais (Figuras 32 e 33). A maioria desses SAS (14/20 e 16/20 para entrenó imaturo e intermediário, respectivamente) apresenta maior expressão em S. spontaneum. Por outro lado, apenas 2 ou 3 genes apresentam maior expressão em S. officinarum.

Tabela 18. Continuação.

Nº Transcrito de milho Anotação Homólogo de cana

43 GRMZM5G803318 Saposin-like type B domain SCCCLR1070A11.g

44 Zm.3374.1.S1_at Protease inhibitor/seed storage/LTP family protein SCCCRZ1001H02.g*

45 GRMZM2G144155 Ankyrin protein kinase-like SCEZLB1013G06.g

46 GRMZM2G329181 Fasciclin-like arabinogalactan protein SCEPRZ1010A01.g

47 Zm.19108 Flavonoid 3',5'-hydroxylase SCEQRT1026H08.g*

48 GRMZM2G104449 Unknown SCCCAM2001D03.g

*Homologia identificada por Blast. Os demais foram identificados pelo programa Inparanoid nd, não determinado

4.11. Identificação de promotores de genes associados ao metabolismo de parede