Sabendo-se que o LIQ pode apresentar uma variação de até 20% (NAGAJARA et al., 1999; KARNES et al., 1991; UH et al., 2008), para este parâmetro foram realizadas uma curva de calibração em simplicata e três sextuplicatas do primeiro ponto da curva (0,25ng/mL). Para diluição das amostras foi utilizada água Milli-Q® autoclavada e batizada para uma concentração de 0,25ng/mL.
4.13.2.2 Especificidade e Seletividade
Neste parâmetro foram realizados ensaios com amostras Verdadeiro Negativas, ou seja, em amostras negativas para microcistina e/ou nodularina confirmadas por Espectrometria de Massas, como descrito no item 4.2 deste trabalho, com algumas modificações. Um total de 9 amostras negativas foram ensaiadas em duplicata em um mesmo dia.
Através dessas análises foi possível determinar o Limite para Aprovação da Amostra Negativa, através do cálculo abaixo:
onde,
LAAN refere-se ao Limite de Aprovação da Amostra Negativa (%);
IRLQ(%) refere-se ao Índice de Reatividade referente ao LQ (%).
A amostra foi considerada APROVADA pelo método ELISA competição quando o Índice da amostra era inferior à 20% do LIQ, ou seja, quando o Índice da amostra for menor ou igual ao Índice do menor ponto da curva de calibração (0,25ng/mL) x 0,2. Sob essas condições a amostra também foi considerada Verdadeiro Negativa. Esse conceito é apresentado nas normas, onde o LIQ deve distinguir-se de uma amostra negativa por um fator de cinco vezes (20%).
4.13.2.2.1 Influência do metanol no ensaio ELISA competição
Amostras de água Milli-Q® autoclavadas foram contaminadas separadamente
com o padrão de MCLR (Sigma®, EUA), padrão nodularina (Sigma®, EUA) e metanol em diversas concentrações.
Essas amostras foram ensaiadas de acordo com o método aqui desenvolvido com Caseína (metodologia descrita no item 4.13.1.4) e com o kit comercial Abraxis®,
EUA. Vale lembrar que, mesmo o kit comercial apresentando calibradores e controles próprios, o padrão Sigma® (EUA) MCLR foi avaliado no mesmo ensaio.
Após obtenção da absorbância das amostras foram obtidos o Índice de Reatividade (como descrito no item 4.13.1.3) e, a concentração calculada das
amostras a partir de uma curva de calibração construída utilizando modelo matemático logarítmico.
4.13.2.2.2 Protocolo kit comercial Abraxis® - ELISA competição indireto
Inicialmente, em poços previamente sensibilizados com o antígeno OVA- ADDA ou BSA-ADDA (proteína carreadora acoplada ao grupamento ADDA), foram incubados (em simplicata) 50µL dos controles, calibradores e amostras e, 50µL da solução anticorpo do kit (anticorpo IgG anti-MCLR), respectivamente. Após incubação a temperatura ambiente durante 90min os poços foram lavados 3 vezes com a solução de lavagem do kit e, posteriormente foi adicionado 100µL da solução conjugado (anticorpo anti-Fc de IgG marcado com peroxidase). Após 30min de incubação a temperatura ambiente, foram repetidas as lavagens e acrescido 100µL da solução substrato do kit (solução cromógena TMB). Os poços foram incubados a temperatura ambiente durante 20 a 30min, sob proteção da luz e, em seguida foi acrescido 50µL da solução stop do kit (ácido sulfúrico diluído). A leitura da reação foi lida em espectrofotômetro em comprimento de onda 450 nm.
4.13.2.3 Recuperação
4.13.2.3.1 Processo de extração
Amostras de água (água Milli-Q®, EUA) autoclavadas ou amostra da natureza
Verdadeiro Negativa) foram submetidas ao seguinte processo de extração:
(i) adição ou não de uma concentração conhecida de MCLR (padrão Sigma®, EUA);
(ii) sonicação da amostra por 30seg em gelo, utilizando probe ultrasônica (VirSonic®, EUA), 20kHz;
(iii) filtração da amostra em filtro 0,45µm (filtro Millex HV com membrana PVDF, 13mm diâmetro Millipore®, EUA);
(iv) centrifugação da amostra durante 5min em centrífuga Eppendorf® 5804
(BioResearch do Brasil®, Brasil), 154g, 4ºC;
4.13.2.3.2 Amostra em Solução, Amostra em Matriz Extraída e Amostra em Matriz
Para esta figura de mérito, as amostras foram divididas em três tipos de grupos:
(i) amostra preparada em solução (SÇÃO) (ii) amostra em matriz extraída (EXT) (iii) amostra em matriz (MTZ)
A curva de calibração foi realizada em simplicata e, cada controle (alto, médio e baixo) em sextuplicata, para cada grupo, em um mesmo dia.
No grupo SÇÃO, uma amostra de água Milli-Q® autoclavada foi batizada com
concentrações conhecidas do padrão MCLR, mas não foram submetidas ao processo de extração.
No grupo EXT, após uma amostra da natureza Verdadeiro Negativa ter sido aliquotada e batizada com concentrações conhecidas de MCLR (controles alto, médio e alto), cada uma foi submetida ao processo de extração descrito no item 4.13.2.3.1.
No grupo MTZ, após uma amostra Verdadeiro Negativa da natureza ter sido submetida ao processo de extração, a mesma foi aliquotada e batizada com concentrações conhecidas de MCLR (controles alto, médio e alto).
Posteriormente a estes três experimentos, cada amostra foi ensaiada pelo método ELISA competição e, a partir da média dos Índices de Reatividade (%) de cada grupo de controle, foram calculadas a Recuperação Absoluta (%), Recuperação Relativa (%) e Efeito Matriz (%), conforme as equações abaixo:
Média IR EXT Média IR SÇÃO x 100 Rec. Absoluta (%) = Média IR EXT Média IR MTZ x 100 Rec. Relativa (%) = Média IR MTZ Média IR SÇÃO x 100 - 100 Efeito Matriz (%) =
onde, IR corresponde ao Índice de Reatividade (%) de cada controle. 4.13.2.4 Linearidade
Costuma-se considerar que a linearidade do método refere-se a resposta do método como um todo, de forma que a análise de uma amostra de concentração conhecida e certificada dentro da faixa de concentração do método deve produzir respostas equivalentes, independentemente da concentração. Por exemplo, se a concentração da amostra é 1ng/mL a resposta do método deve ser igual a 1ng/mL, se for 10ng/mL a resposta deve ser 10ng/mL, e assim sucessivamente.
A linearidade da resposta do instrumento ou da análise instrumental ou da metodologia analítica não precisa ser necessariamente linear, desde que o modelo matemático corrija os valores, de modo que o método como um todo seja linear (UH
et al., 2008).
Para a curva de calibração, foram escolhidos 8 pontos distribuídos de forma eqüidistantes, tendo como base a concentração de interesse (1ng/mL). A curva foi construída a partir de amostras de água Milli-Q® autoclavada e batizadas nas
seguintes concentrações de MCLR 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 1,75 e 2,0ng/mL (padrão Sigma®, EUA).
O estudo da linearidade da metodologia analítica incluiu a análise de 9 curvas de calibração e cálculo do Desvio do Valor Nominal (Des (%)) em função logarítmica (ln) de cada ponto da curva de calibração (ver item 4.13.2.5). A partir daí, foi elaborado um gráfico do tipo dispersão e, realizada a análise da Distribuição dos Resíduos com Relação à Concentração Nominal de MCLR em função log.
O estudo da linearidade do método relacionou a concentração nominal dos controles alto, médio e alto, com a Recuperação Absoluta (%), previamente calculada no item 4.13.2.3.2. A partir daí, foi elaborado um gráfico do tipo dispersão e realizada a análise da Distribuição dos Resíduos com Relação à Concentração Nominal de MCLR calculados seguindo o modelo matemático de regressão linear. Também foi adicionada uma linha de tendência e calculado o quadrado do coeficiente de correlação linear (R2).
A qualidade do resultado de um método analítico é altamente dependente da qualidade da curva de calibração, já que a concentração do composto de interesse numa amostra desconhecida á calculada a partir dos resultados de análise de
regressão obtidos da curva de calibração (ALMEIDA et al., 2002). Por isso, tendo em vista a relevância de uma curva de calibração ideal ao método, foi aplicado o teste de homocedasticidade ao método ELISA competição padronizado. No modelo de regressão linear dos mínimos quadrados pressupõe-se uma igualdade de variâncias entre todos os pontos da curva (homocedasticidade). No entanto, este modelo é mais influenciado pelo desvio padrão das concentrações mais altas da curva do que pelo desvio padrão das concentrações mais baixas, provocando uma redução da precisão nas concentrações mais baixas (ALMEIDA et al., 2002). Para contrabalancear este ponto indesejável, principalmente para métodos que usualmente determinam concentrações baixas do analito nas amostras, foi escolhido o melhor modelo matemático que descreva a resposta do ensaio de ELISA competição, ou seja, do modelo que apresentou uma melhor distribuição dos desvios.