Dönel Kavşakların Geometrik Özellikler

A atividade de monitoramento de cianobactérias de reservatórios para abastecimento público tal como determina a Portaria MS 518/2004 (BRASIL 2004) poderia ser facilitada por metodologias mais rápidas e que contornem a dificuldade de visualização de células em indivíduos coloniais (BERNARD et al. 2004) o que ocorre comumente ocorre em contagens de fitoplâncton realizadas em câmaras de Sedwick- Rafter.

Em virtude da PCR convencional não ser essencialmente quantitativa e de a PCR em tempo real, apesar de quantitativa, ser onerosa e de manipulação complexa,

esperou-se com este estudo avançar no conhecimento sobre a detecção de cianobactérias utilizando a capacidade quantitativa da PCR competitiva.

Estudos envolvendo a quantificação de cianobactérias por PCR competitiva são escassos no mundo e inexistem no Brasil. Desta forma, este estudo é pioneiro no desenvolvimento e investigação desta metodologia para quantificação de células de amostras ambientais brasileiras.

Dentre os métodos baseados na PCR, a em tempo real e a competitiva são consideradas as mais sensíveis e exatas (ZENTILIN e GIACCA 2007).

Miura et al. (2008) observaram que a PCR em tempo real poderia ser usada como um ensaio de alta qualidade por descartar o uso de qualquer manuseio dos produtos amplificados pós-PCR. No entanto, a PCR em tempo real é altamente influenciada pela natureza estocástica e pela qualidade dos moldes nas primeiras fases de amplificação. Neste contexto a PCR competitiva é mais robusta do que a PCR em tempo real, apesar de sua aplicação em larga escala ser dificultada pela necessidade de preparo de competidores padronizados para cada gene quantificado (MIURA et al. 2008)

A razão da quantificação de células da amostra ambiental por PCR competitiva utilizando o gene mcyB e o número obtido pela contagem direta foi igual a 186. Já é conhecido, através de seqüenciamento, que Microcystis spp. tem apenas uma cópia do operon mcy (TANABE et al. 2004). Deste modo a metodologia utilizada no presente estudo superestimou o número de células tóxicas da amostra ambiental em duas ordens de magnitude.

Resultado semelhante encontrou Vaitomaa et al. (2003) utilizando PCR em tempo real para quantificar genótipos de mcyE. O número de cópias de mcyE de

Microcystis e Anabaena existentes nos corpos d´água pesquisados foram de 2 a mais de 200 vezes maior do que o número de células detectado por microscopia óptica. Erros metodológicos na contagem de células por microscopia óptica seria uma possível

explicação segundo estes autores, ou ainda, haver mais de um gene por célula, o que acarretaria mais de uma cópia de mcyE.

Falhas metodológicas de contagem por microscopia óptica que ocasionem erros de quantificação por PCR em tempo real de uma a duas ordens de grandeza, tal como sugerido por Vaitomaa et al. (2003), são muito elevados e dificilmente ocorrem. Além disso, a sugestão de haver mais de uma cópia do gene mcyE por célula é questionável, pois o seqüenciamento de Microcystis spp. revelou possuir apenas uma cópia do operon mcy (TANABE, et al. 2004).

Yoshida et al (2005) quantificou o número de genótipos de mcyA em amostras ambientais de um corpo d´água japonês com floração de Microcystis aeruginosa utilizando a metodologia de PCR competitiva. Uma das três amostras investigadas revelaram ter razão de número de genótipos de mcyA por células de 2,37. Yoshida et al. (2005) levantaram a hipótese de que células não coloniais não foram contabilizadas na contagem direta, constituindo um erro metodológico na contagem.

Furukawa et al. (2006) e Ha et al. (2009) quantificaram os genes mcyA da linhagem Microcystis aeruginosa NIES102 utilizando a metodologia PCR em tempo real. Furukawa et al. (2006) encontraram erros de 2 a 64% entre contagem direta e PCR em tempo real de mcyA enquanto que Ha et al. (2009) demonstraram superestimação de

mcyA nas células de Microcystis assumindo existir 14 cópias de mcyA por célula. Tais discrepâncias de resultados indicam que mesmo a PCR em tempo real tida como uma ferramenta de alta sensibilidade e acurácia, apresentou dificuldades para quantificar células tóxicas de Microcytis a partir de genes mcy.

Neste estudo, a razão entre quantificação de células por PCR competitiva utilizando cpcBA competidor e a contagem direta foi de 83. Portanto pode-se sugerir que o número de cópias do gene da ficocianina (cpcBA) na amostra de Duas Unas, PE, seja maior 83 vezes do que nas linhagens BCCUSP3 e 18. Contudo, tal suposição seria pouco provável visto que seqüenciamento de Microcystis aeruginosa revelou apenas uma cópia do gene da ficocianina (KANEKO et al. 2007). Com isso, os resultados aqui

encontrados não expressam o número de cópias do gene cpcBA existentes no genoma desta cianobactéria.

Resultados contrários aos descritos acima foram encontrados por Kurmayer e Kutzenberger (2003) e Schober et al. (2007) os quais encontraram relação precisa entre o número de células e o número de genes cpcBA e mcyB utilizando a técnica de PCR em tempo real. Kurmayer e Kutzenberger (2003) quantificaram células totais de

Microcystis spp. coletadas em 17 meses consecutivos no Lago Wannsee. Os autores observaram que número de genes de cpcBA se equivalem ao número de células contadas em microscópio invertido. Schober et al. (2007) encontraram proporção constante de genes mcyB e cpcBA correspondente 1:1 em experimento inter- laboratorial em suas quantificações em amostra ambiental.

Quantificar células tóxicas, seja por PCR competitiva ou PCR em tempo real, incluem a possibilidade de erros intrínsecos afetarem os resultados (HA et al. 2009). Tais erros podem derivar de perda de DNA no processo de sua extração, amplificação ineficiente, aumento da quantidade de DNA nas células em certas fases do crescimento e até mesmo devido à liberação de DNA de células mortas (HA et al. 2009).

De fato, neste estudo uma possível explicação para a superestimação das células quantificadas seria a eficiência diferenciada de amplificação entre DNA alvo e DNA competidor. Sendo o competidor menor do que o alvo, sua amplificação poderia ser facilitada. Deste modo, a PCR competitiva não seria útil para quantificar células em termos absolutos e na exatidão requerida pela Portaria MS518/2004 (BRASIL, 2004). Por outro lado, poderia ser utilizada para estudos sazonais de locais específicos realizando quantificações relativas (proporcionais), já que apresentou alta reprodutibilidade, representados por valores de coeficiente de explicação da reta (R2) altamente significativos.

6. CONCLUSÕES

• A utilização da PCR competitiva para atender a Portaria MS 518/2004 mostrou- se inadequada para quantificar células tóxicas e não tóxicas de Microcystis.

• A metodologia desenvolvida para construção dos DNA competidores foi adequada pois permitiu a co-amplificação do DNA alvo e competidor.

Diante disso rejeitou-se a hipótese apresentada de que a PCR competitiva poderia substituir a técnica da contagem direta de células para atender a Portaria MS 518/2004. Contudo, a metodologia apresentou reprodutibilidade em seus resultados e mostrou potencial de ser utilizada como uma alternativa menos onerosa do que a PCR em tempo real em pesquisas que necessitem de resultados quantitativos relativizados.

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ARMENT, A.R.; CARMICHAEL, W.W. Evidence that microcystins is a thio-template product. Journal of Phycology, v. 32, n.4, p. 591-597, 1996.

ASAYAMA, M.; KABASAWA, M.; TAKAHASHI, I.; AIDA, T.; SHIRAI, M. Highly repetitive sequences and characteristics of genomic DNA in unicellular cyanobacterial strains. FEMS Microbiology Letters, v. 137, n. 2-3, p. 175-181, 1996.

BAKER, J.A.; NEILAN, B.A.; ENTSCH, B.; McKAY, D.B. Identification of cyanobacteria and their toxigenicity in environmental samples by rapid molecular analysis. Environmental Toxicology, v. 16, n. 6, p. 472-482, 2001.

BERNARD, C.; MONIS, P.; BAKER, P. Disaggregation of colonies of Microcystis (Cyanobacteria): efficiency of two techniques assessed using an image analysis system. Journal of Applied Phycology, v.16, n. 2, p. 117-125, 2004.

BITTENCOURT-OLIVEIRA, M.C. Development of Microcystis aeruginosa (Kützing) Kützing (Cyanophyceae/Cyanobacteria) under cultivation and taxonomic implications. Algological Studies, v. 99, p. 29-37, 2000.

BITTENCOURT-OLIVEIRA, M. C. Detection of potencial microcystin-producing cyanobacteria in Brazilian reservoirs with a mcyB molecular marker. Hamful Algae, v. 2, n. 1, p. 51-60, 2003.

BRASIL. Ministério da Saúde. Portaria MS n.º 518/2004. Diário Oficial da República Federativa do Brasil, Poder Executivo, Brasília, DF, 26 de março de 2004. Seção I, p. 266-270.

CARMICHAEL, W.W.; BEASLEY, V.R.; BUNNER, D.L.; ELOFF, J.N.; FALCONER, I.; GORHAM, P.; HARADA, K.I.; KRISHNAMURTHY, T.; YU, M.J.; MOORE, R.E.; RINEHART, K.; RUNNEGAR, M.; SKULBERG, O.M.; WATANABE, M. Naming of cyclic heptapeptide toxins of cyanobacteria (blue-green algae). Toxicon, v.26, n.11, p. 971- 973, 1988.

CARMICHAEL, W.W. The toxins of cyanobacteria. Scientific American, v.270, n.1, p. 78-86; 1994.

CHORUS, I.; FALCONER, I.R.; SALAS, H.J.; BARTRAM, J. Health risks caused by freshwater cyanobacteria in recreational waters. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B: Critical Reviews, v.3, n.4, p. 323-347, 2000.

CHORUS, I. (ed). Cyanotoxin occurrence in freshwaters—A summary of survey results from different countries. Cyanotoxins—Occurrence, causes, consequences , Springer-Verlag., Berlin, p. 75-78, 2001.

DITTMANN, E.; NEILAN, B.A.; ERHARD, M.; VON DÖHREN, H.; BÖRNER, T. Insertional mutagenesis of a peptide synthetase gene which is responsible for hepatotoxin production in the cyanobacterium Microcystis PCC7806. Molecular Microbiology, v. 26, n.4, p. 779-787, 1997.

FALCONER, I.R.; RUNNEGAR, M.T.C.; BUCKLEY, T.; HUYN, V. L.; BRADSHAW, P. Using activated carbon to remove toxicity from drinking-water containg cyanobacterial blooms. Journal American Water Works Association, n.81, v.2, p. 102-105, 1989.

FOULDS, I.V.; GRANACKI, A.; XIAO, C.; KRULL, U.J.; CASTLE, A.; HORGEN, P.A. Quantification of microcystin-producing cyanobacteria and E. coli in water by 50- nuclease PCR. Journal of Applied Microbiology, v.93, n.5, p.825-834, 2002.

FURUKAWA, K.; NODA, N.; TSUNEDA, S.; SAITO, T.; ITAYAMA, T.; INAMORI, Y. Highly sensitive real-time PCR assay for quantification of toxic cyanobacteria based on microcystin synthetase A gene. Journal of Bioscience and Bioengineering, v.102, n.2, p. 90-96, 2006.

GORHAM, P. R. Toxic waterblooms of blue-green algae. Canadian Veterinary Journal, v.1, n.6, p. 235-245, 1960.

GUILLARD, R. R. L. Division rates. In: STEIN, J.R. Handbook of phycological methods: Culture methods and growth measurements. London: Cambridge University Press, 1973. p. 289-311.

HA, J.H.; HIDAKA, T.; TSUNO, H. Quantification of toxic Microcystis and evaluation of its dominance ratio in blooms using Real-Time PCR. Environmental Science & Technology, v.4, n.3, p. 812-818, 2009.

HART, J.; FAWELL, J.K.; CROLL, B. The fate of both intra and extracellular toxins during drinking water treatment. IWSA World Congress, Blackwell Science, Oxford, v.18, n.18, p. 1-6, 1997

HIMBERG, K.; KEIJOLA, A. M.; HIISVIRTA, L.; PYYSALO, H.; SIVONEN, K. The effect of water treatment processes on the removal of hepatotoxins from Microcystis and

Oscillatoria cyanobacteria: A laboratory study. Water Research, v. 23, n. 8, p. 979-984, 1989.

HISBERGUES, M.; CHRISTIANSEN, G.; ROUHIAINEN, L.; SIVONEN, K.; BÖRNER, T. PCR-based identification of microcystin-producing genotypes of different cyanobacterial genera. Archives of Microbiology, v.180, n.6, p.402-410, 2003.

HOOSER, S.B.; BEASLEY, V.R.; BASGALL, E.J.; CARMICHAEL, W.W.; HASCHEK W.M. Microcystin-LR-induced ultrastrutural changes in rats. Veterinary Pathology, v.27, n.1, p. 9-15, 1990.

HOOSER, S. B.; BEASLEY, V. R.; WAITE, L. L.; KUHLENSCHMIDT, M. S.; CARMICHAEL, W. W.; HASCHEK, W. M. Actin filament alterations in rat hepatocytes induced in vivo and in vitro by microcystin-LR, a hepatotoxin from the blue-green alga,

Microcystis aeruginosa. Veterinary Pathology, v.28, n.4, p. 259-266, 1991.

HOTTO, A.M.; SATCHWELL, M.F.; BERRY, D.L.; GOBLER, C.J.; BOYER, G.L. Spatial and temporal diversity of microcystins and microcystin-producing genotypes in Oneida Lake, NY. Harmful Algae, v.7, n.5, p.671–681, 2008.

HRUDEY, S.; BURCH, M.; DRIKAS, M.; GREGORY, R. Remedial Measures. In: Chorus, I; Bartram, J. (Eds). Toxic Cyanobacteria in Water: A guide to their Public Health Consequences, Monitoring and Management. E&F Spoon, London; p. 267- 302, 1999.

HUGHES, E. O.; GORHAM, P. R.; ZEHNDER, A. Toxicity of a unialgal culture of

Microcystis aeruginosa. Canadian Journal of Microbiology, v.4, n.3, p. 225-236, 1958.

JOCHIMSEN, E.M.; CARMICHAEL, W.W.; AN, J.; CARDO, D.; COOKSON, S.T.; HOLMES, C.E.M.; ANTUNES, M.B.C.; MELO-FILHO, D.A.; LYRA, T.M.; BARRETO, V.; AZEVEDO, S.M.F.O.; JARVIS, W.R. Liver failure and death after exposure to microcystin toxins at a hemodialysis center in Brazil. New England of Journal of Medicine, v.338, v.13, p. 873-878, 1998.

JUNG, R.; SOONDRUM, K.; NEUMAIER, M. Quantitative PCR. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, v. 38, n. 9, p. 833-836, 2000.

KABAERNICK, M.; NEILAN, B.A. Ecological and molecular investigations of cyanotoxin production. FEMS Microbiology Ecology, v. 35, n. 1, p. 1-9, 2001.

KANEKO, T.; NAKAJIMA, N.; OKAMOTO, S.; SUZUKI, I.; TANABE, Y.; TAMAOKI, M.; NAKAMURA, Y.; KASAI, F.; WATANABE, A.; KAWASHIMA, K.; KISHIDA, Y.; ONO, A.; SHIMIZU, Y.; TAKAHASHI, C.; MINAMI, C.; FUJISHIRO, T.; KOHARA, M.; KATOH, M.; NAKAZAKI, N.; NAKAYAMA, S.; YAMADA, M.; TABATA, S.; WATANABE, M.M. Complete genomic structure of the bloom-forming toxic cyanobacterium Microcystis aeruginosa NIES-843. DNA Research, v. 14, n. 6, p. 247-256, 2007.

KLEINKAUF, H., VON DÖHREN, H. A non-ribosomal system of peptide biosynthesis. European Journal of Biochemistry, v. 236, n. 2, p. 335-351, 1996.

KONST, H.; MCKERCHER, P.D.; GORHAM, P.R.; ROBERTSON, A.; HOWEL, J. Symptoms and Pathology Produced By Toxic Microcystis aeruginosa NRC-1 in Laboratory and Domestic Animals. Canadian Journal of Comparative Medicine and Veterinary Science, v. 29, n. 9, p. 221-228, 1965.

KOSKENNIEMI, K.; LYRA, C.; RAJANIEMI-WACKLIN, P.; JOKELA, J.; SIVONEN, K. Quantitative real-time PCR detection of toxic Nodularia cyanobacteria in the Baltic Sea. Applied and Environmental Microbiology, v. 73, n. 7, p.2173-2179, 2007.

KURMAYER, R.; DITTMANN, E.; FASTNER, J.; CHORUS, I. Diversity of microcystin genes within a population of the toxic cyanobacterium Microcystis spp. in Lake Wannsee (Berlin, Germany). Microbial Ecology, v. 4, n. 3, p. 107-118, 2002.

KURMAYER R, KUTZENBERGER T. Application of real-time PCR for quantification of microcystin genotypes in a population of the toxic cyanobacterium Microcystis spp. Applied and Environmental Microbiology, v. 69, n. 11, p. 6723-6730, 2003.

KURMAYER, R.; CHRISTIANSEN, G.; FASTNER, J.; BORNER, T. Abundance of active and inactive microcystin genotypes in populations of the toxic cyanobacterium

Planktothrix spp. Environmental Microbiology, v.8, n. 6, p. 831-841, 2004.

LAHTI, K.; KILPONEN, J.; KIVIMÄKI, A.L.; ERKOMAA, K.; SIVONEN, K. Removal of cyanobacteria and their hepatotoxins from raw water in soil and sediment columns. In Artificial Recharge of Groundwater. Kivimäki, AL e Suokko, T [Eds] NHP/Report no_.

38, Helsinki, 187-195, 1996.

MACKINTOSH, C.; BEATTIE, K.A.; KLUMPP, S.; COHEN, P.; CODD, G.A. Cyanobacterial microcystin-LR is a potent and specific inhibitor of protein phosphatases 1 and 2A from both mammals and higher plants. FEBS LETTERS, v.264, n.2, p. 187- 192, 1990.

MANKIEWICZ-BOCZEK, J.; IZYDORCZYK, K.; ROMANOWSKA-DUDA, Z.; JURCZAK, T.; STEFANIAK, K.; KOKOCINSKI, M. Detection and monitoring toxigenicity of cyanobacteria by application of molecular methods. Environmental Toxicology, v. 21, n. 4, p. 380-387, 2006.

MARAHIEL, M.A.; NAKANO, M.M.; ZUBER, P. Regulation of peptide antibiotic production in Bacillus. Molecular Microbiology, v. 7, n. 5, p. 631-636, 1993.

MEIǺNER, K.; DITTMANN, E.; BÖRNER, T. Toxic and non-toxic strains of the cyanobacterium Microcystis aeruginosa contain sequences homologous to peptide synthetase genes. FEMS Microbiology Letters, v. 135, n. 2-3, p. 295-303, 1996.

MIURA G. A.; ROBINSON N. A.; GIISBERT T. W.; BOSTIAN K. A.; WHITEJ. D.; PACE J. G. Comparison of in vivo and in vitro toxics efects of microcystin-LR in fasted rats. Toxicon, v. 27, n. 11, p. 1229-1240, 1989.

MIURA, F.; KAWAGUCHI, N.; YOSHIDA, M.; UEMATSU, C.; KITO, K.; SAKAKI, Y.; ITO, T. Absolute quantification of the budding yeast transcriptome bymeans of competitive PCR between genomic and complementary. DNAs BMC Genomics, v. 574, n. 9, p. 1-14, 2008.

MÖLLER, A.; JANSSON, J.K. Quantification of genetically tagged cyanobacteria in Baltic Sea sediment by competitive PCR. Biotechniques, v. 22, n. 3, p. 512-518, 1997.

MSAGATI, T.A.M.; SIAME, B.A.; SHUSHU, D.D. Evaluation of methods for the isolation, detection and quantification of cyanobacterial hepatotoxins. Aquatic Toxicology, v. 78, n. 4, p. 382-39, 2006.

MUMY, K. L.; FINDLAY, R. H. Convenient determination of DNA extraction efficiency using an external DNA recovery standard and quantitative-competitive PCR. Journal of Microbiological Methods, v. 57, n. 2, p. 259– 268, 2004.

NEILAN, B.A. Identification and phylogenetic analisys of toxigenic cyanobacteria by multiplex ramdomly amplified polymorphic DNA PCR. Applied and Environmental Microbiology, v. 61, n. 6, p. 2286-2291, 1995.

NEILAN, B.A.; JACOBS, D.; GOODMAN, A.E. Genetic diversity and phylogeny of toxic cyanobacteria determined by DNA polymorphisms within the phycocyanin locus. Applied Environmental Microbiology, v. 61, n. 11, p. 3875-3883, 1995.

NEILAN, B. A.; JACOBS, D.; DEL DOT, T.; BLACKALL, L.L.; HAWKINS, P.R.; COX, P.T; GOODMAN, A.E. rRNA sequences and evolutionary relationships among toxic and

nontoxic cyanobacteria of the genus Microcystis. International Journal of Systematic Bacteriology, v. 47, n. 3, p. 693-697, 1997.

NICHOLSON, B.C.; ROSITANO, J.; BURCH, M.D. Destruction of cyanobacterial peptide hepatotoxins by chlorine and chloramine. Water Research, v. 28, n. 6, p. 1297-1303, 1994.

NISHIHARA, H.; MIWA, H.; WATANABE, M.; NAGASHIMA, M.; YAGI, O.; TAKAMURA, Y.. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) analyses for discriminating genotypes of Microcystis cyanobacteria. Bioscience Biotechnology Biochemistry, v. 61, n.7, p. 1067-1072, 1997.

NISHIZAWA, T.; ASAYAMA, M.; FUJII, K.; HARADA, K.; SHIRAI, M. Genetic analysis of the peptide synthetase genes for a cyclic heptapeptide microcystin in Microcystis spp. Journal of Biochemistry, v.126, n. 3, p. 520–529, 1999.

NISHIZAWA, T.; UEDA, A.; ASAYAMA, M.; FUJII, K.; HARADA, K.; OCHI, K.; SHIRAI, M. Polyketide synthase gene coupled to the peptide synthetase module involved in the biosynthesis of the cyclic heptapeptide microcystin. Journal of Biochemistry, v. 127, n. 5, p. 779–789, 2000.

OSTEMAIER, V.; KURMAYER, R. Distribution and abundance of non-toxic mutants of cyanobacteria in Lakes of the Alps. Microbial Ecology, v. 58, n. 2, 323-333, 2009.

OTSUKA, S.; SUDA, S.; LI, R.; WATANABE, M., OYAIZU, H.; MATSUMOTO, S.; WATANABE, M.M. 16S rDNA sequences and phylogenetic analyses of Microcystis strains with and without phycoerythrin. FEMS Microbiology Letters, v. 164, n. 1, p. 119-124, 1998.

POURIA, S.; ANDRADE, A.; BARBOSA, J.; CAVALCANTI, R.L.; BARRETO, V.T.S.; WARD, C.J.; PREISER, W.; POON, G.K.; NEILD, G.H.; CODD, G.A. Fatal microcystin intoxication in haemodialysis unit in Caruaru, Brazil. Lancet, v. 352, n. 9121, p. 21-26, 1998.

RINTA-KANTO, J.M.; OUELLETTE, A.J.; BOYER, G.L., TWISS, M.R.; BRIDGEMAN, T.B.; WILHELM, S.W. Quantification of toxic Microcystis spp. during the 2003 and 2004 blooms in western Lake Erie using quantitative real-time PCR. Environmental Science and Technology, v. 39, n. 11, p. 4198-4205, 2005.

RIPPKA, R.; DERUELLES, J.; WATERBURY, J. B.; HERDMAN, M.; STANIER, R.Y. Generic assigments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria. Journal of General Microbiology, v. 111, n. 1, p. 1-61, 1979.

ROGERS, S.O.; BENDICH, A.J. Extration of DNA from milligram amounts of fresh herbarium and mummified plant tissues. Plant Molecular Biology, v. 5, n. 2, p. 69-76, 1985.

ROUHIAINEN, L., SIVONEN, K.; BUIKEMA. W.J.; HASELKORN, R. Characterization of toxin-producing cyanobacteria by using an oligonucleotide probe containing a tandemly repeated heptamer. Journal of Bacteriology, v. 177, n. 20, p. 6021-6026, 1995.

ROZEN, S.; SKALETSKY, H. J. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology, Krawetz, S.; Misener, S. (ed), Humana Press, Totowa, NJ, p. 365-386, 2000.

RUDI, K.; SKULBERG, O.M.; JAKOBSEN, K. S. Evolution of cyanobacteria by exchange of genetic material among phyletically related strains. Journal of Bacteriology, v. 180, n. 13, p. 3453-3461, 1998.

RUDI, K.; SKULBERG, O.M.; LARSEN, F.; JAKOBSEN, K.S. Quantification of Toxic Cyanobacteria in Water by Use of Competitive PCR Followed by Sequence-Specific Labeling of Oligonucleotide Probes. Applied Environmental Microbiology, v. 64, n. 7, p. 2639–2643, 1998.

SAKER, M.L.; VALE, M.; KRAMER, D. Molecular techniques for the early warning of toxic cyanobacteria blooms in the freshwater lakes and rivers. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 75, n. 2, p. 441-449, 2007.

SCHOBER, E.; WERNDL, M.; LAAKSO, K.; KORSCHINECK, I. Interlaboratorial comparison of Taq Nuclease Assays for the quantification of the toxic cyanobacteria

Microcystis sp. Journal of Microbiological Methods, v. 69, n. 1, p. 122–128, 2007.

SIEBERT, P.D.; LARRIK, J.M. Competitive PCR. Nature, v. 359, n. 6395, p. 557-558, 1992.

SIVONEN, K.; JONES, G. Cyanobacterial toxins. In: Toxic Cyanobacteria in Water: A guide to their Public Health Consequences, Monitoring and Management, Chorus, I.; Bartram, J. (Ed). E&F Spoon, London, p. 55-124, 1999.

SMITH, V.H. Eutrophication of freshwater and coastal marine ecosystems: a global problem. Environmental Science Pollution Research, v. 10, n. 2, p. 126-139, 2003.

SOARES, R.M.; YUAN, M.; SERVAITES, J.C.; DELGADO, A.; MAGALHÃES, V.F.; HILBORN, E.D.; CARMICHAEL, W.W.; AZEVEDO, S.M.F.O. Sublethal exposure from microcystins to renal insufficiency patients in Rio de Janeiro, Brazil. Environmental Toxicology, v. 21, n. 2, p. 95-103, 2006.

TANABE, Y.; KAYA, K.; WATANABE, M.M. Evidence for recombination in the microcystin synthetase (mcy) genes of toxic cyanobacteria Microcystis spp. Journal of Molecular Evolution, v. 58, n. 6, p. 633-641, 2004.

TEIXEIRA, M.G.L.C.; COSTA, M.C.N.; CARVALHO, V.L.P.; PEREIRA, M.S.; HAGE, E. Gastroenteritis epidemic in the area of the Itaparica Dam, Bahia, Brazil. Bulletin of the Pan American Health Organization, v. 27, n. 3, p. 244-253, 1993.

TILLETT, D.; DITTMANN, E.; ERHARD, M.; VON DÖHREN, H.; BÖRNER, T.; NEILAN, B.A. Structural organization of microcystin biosynthesis in Microcystis aeruginosa PCC7806: an integrated peptide-polyketide synthetase system. Chemistry & Biology, v. 7, n. 10, p. 753-764, 2000.

TILLETT, D.; PARKER, D. L.; NEILAN, B. A. Detection of toxigenicity by a probe for the microcystin synthetase A gene (mcyA) of the cyanobacterial genus Microcystis:

comparison of toxicities with 16S rRNA and phycocyanin operon (phycocyanin intergenic spacer) phylogenies. Applied and Environmental Microbiology, v. 67, n. 6, p. 2810- 2818, 2001.

UENO, Y.; NAGATA, S.; TSUTSUMI, T.; HASEGAWA, A.; WATANABE, M. F.; PARK, H. D.; CHEN, G. C.; CHEN, G.; YU, S.Z. Detection of microcystins, a blue-green algal hepatotoxin, in drinking water sampled in Haimen and Fusui, endemic areas of primary liver cancer in China, by highly sensitive immunoassay. Carcinogenesis, v. 17, n. 6, p. 1317–1321, 1996.

VAITOMAA, J., RANTALA, A., HALINEN, K., ROUHIAINEN, L., TALLBERG, P., MOKELKE, L., SIVONEN, K. Quantitative real-time PCR for determination of microcystin synthetase e copy numbers for Microcystis and Anabaena in lakes. Applied and Environmental Microbiology, v. 69, n. 12, p. 7289-7297, 2003.

VALÉRIO, E.; CHAMBEL, L.; PAULINO, S.; FARIA, N.; PEREIRA, P.; TENREIRO, R. Multiplex PCR for detection of microcystins-producing cyanobacteria from freshwater samples. Environmental Toxicology, DOI 10.1002/tox.20502, 2009.

[WHO] WORLD HEALTH ORGANIZATION. Cyanobacterial Toxins: Microcystin-LR. Guideline for Drinking Water Quality. Addendum to Volume 2, Geneva, p. 95-110, 1998.

WICKSTROM, M.L.; KHAN, S.A.; HASCHEK, W.M.; WYMAN, J.F.; ERIKSSON, J.E.; SCHAEFFER, D.J.; BEASLEY, V.R. Alterations in microtubules, intermediate filaments, and microfilaments induced by microcystin-LR in cultured cells. Toxicologic Pathology v. 23, n. 3, p. 326-337, 1995.

WOESE, C.R.; KANDLER, O.; WHEELIS, M.L. Towards a Natural System of Organisms: Proposal for the Domains Archaea, Bacteria and Eucarya. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America, v. 87, n. 12, p. 4576-4579, 1990.

YOSHIDA, T.; YUKI, Y.; LEI, S.; CHINEN, H.; YOSHIDA, M.; KONDO, R.; HIROISHI, S. Quantitative detection of toxic strains of the cyanobacteria genus Microcystis by competitive PCR. Microbes and Environments, v. 18, n. 1, p. 16-23, 2003.

YOSHIDA, M.; YOSHIDA, T.; TAKASHIMA, Y.; KONDO, R.; HIROISHI, S. Genetic diversity of the toxic cyanobacterium Microcystis in Lake Mikata. Environmental Toxicology, v. 20, n. 3, p. 229-234, 2005.

ZENTILIN, L.; GIACCA, M. Competitive PCR for precise nucleic acid quantification. Nature Protocols, v. 2, n. 9, p. 2092-2104, 2007.

ZHOU, L.; YU, H.; CHEN, K. Relationship between microcystin in drinking water and colorectal cancer. Biomedical Environmental Sciences, v. 15, n. 2, p. 166–171, 2002.

ZURAWELL, R.W.; CHEN, H.R.; BURKE, J.M.; PREPAS, E. Hepatotoxic cyanobacteria: A review of the biological importance of microcystins in freshwater environments. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B: Critical Reviews, v. 8, n. 1, p. 1-37, 2005.