Computer program

Para a análise de imunohistoquímica, os cortes foram desparafinizados e hidratados e etanol e depois água. Nos cortes hidratados foi feito a recuperação antigênica em tampão citrato 10mM (pH 6.1) por 15 min a 95ºC em forno microondas seguido pelo resfriamento por 20 min á temperatura ambiente. Os cortes foram lavados por 5 min em tampão fosfato (PBS). Depois disso, os cortes foram circulados com uma caneta hidrofóbica (Dako pen). Os cortes foram incubados por 15 min em solução de peróxido de hidrogênio a 3% para o bloqueio da peroxidase endógena e lavados por 5 min em PBS. Os cortes foram então incubados com anticorpo policlonal primário anti-c-Fos, anti-NOSi ou anti-nitrotirosina feitos em coelho ou cabra (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), a 4ºC por toda a noite. No dia seguinte os cortes foram então lavados em PBS por 5 min e incubados por 30min na temperatura ambiente com o anticorpo secundário biotinilado anti-IgG de coelho ou cabra (Santa Cruz Biotechnology,CA, USA). Depois de mais uma lavagem com PBS, os cortes de tecido foram incubados com um reagente enzimático AB (streptavidina (reagente A – Avidina e reagente B – peroxidase horseradish biotinilado, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) por 30 min. Depois de uma lavagem final em PBS, os cortes de tecido foram cobertos com uma solução contendo cromógeno diaminobenzidina (DAB liquido + Sistema Chromogen Substrato, Dako North America, Carpinteria, CA, USA) por dois minutos e então enxaguado em água destilada por 2 vezes durante 5 min cada. Os cortes foram desidratados e montados em meio de montagem rápida (Entellan, Merck, Germany) e examinados com um microscópio Leica (Leica, Wetzlar, Germany). Depois de focar as lâminas, nós fotografamos os cornos dorsais das medulas no aumento de 400x.

A análise imunohistoquímica, para amostras de 5 animais, considerou um escala de escores de 0 – 3, baseado nos seguintes parâmetros: 0 (zero) – ausência de expressão; 1(um) – expressão leve; 2(dois) – expressão moderada e 3(três) – expressão intensa. A análise foi realizada por um investigador que era cego ao tratamento (GONDIM et al., 2011).

3.7

Ensaios bioquímicos em tecido medular

Esses grupos, entre os quais a glutationa, promove citoproteção prevenindo os vários tecidos dos danos oxidativos pelos radicais livres.

Os camundongos submetidos a neuropatia induzida pela oxaliplatina, e tratados com rutina e quercetina, foram sacrificados por altas doses de anestésico e o segmento L4-L5 da medula espinhal foi removido. Os tecidos foram imediatamente congelados em nitrogênio líquido e estocados em freezer a -80ºC, até serem usados. Para o experimento, as amostras foram descongeladas. O conteúdo de glutationa reduzida (GSH) na medula espinhal, como sulfidrilas não protéicas, foi estimado de acordo ao método descrito por SEDLAK e LINDSAY, 1968. Os segmentos de medula espinhal, foram homogeneizadas no gelo, em 1mL de solução 0,02M de EDTA/100mg de tecido. Então alíquotas de 400µl de tecido homogeneizado foram misturados com 320 µl de água destilada e 80 µl de ácido tricloroacético em tubos de vidro e centrifugados a 3000g por 15 min a 4ºC. Os sobrenadantes (400 µl) foram misturados com 800 µl de tampão Tris (0,4 M, pH 8,9), e 20 µl DTNB 0,01 M (ácido 2- nitrobenzoico) foi adicionado. A absorbância foi lida a 412 nm em 5 min de adição de DTNB contra um reagente branco sem nenhum homogeneizado. A concentração dos níveis de NP-SH foi registrado com µg/mg de tecido.

3.7.2 Malondialdeído (MDA)

Os camundongos submetidos a neuropatia induzida pela oxaliplatina e tratados com rutina e quercetina, foram sacrificados por altas doses de anestésicos e o segmentos L4-5 da medula espinhal foram removidos. Os tecidos foram imediatamente congelados em nitrogênio líquido e estocado a -80ºC até serem usados. A peroxidação lipídica foi determinada pela mensuração do malondialdeído produzido, usando o teste das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS; MIHARA e UCHIYAMA, 1978). Em suma, 250 µl de tecido homogeneizado mais 1,5 ml de H3PO4 10% e 0,5 ml de ácido tiobarbitúrico 0,6%, misturada e aquecida em banho-maria de água fervente por 45 min. Depois de resfriar, 2 mL de n-butanol foi adicionado, misturado e a camada de butanol foi coletada após centrifugação. A densidade ótica da camada de n-butanol foi determinada a 535 e 520 nm e a diferença da densidade ótica entre ambos os resultados determinados foi calculada e considerada com o valor do ácido tiobarbitúrico. As concentrações de MDA foram expressas como nanomoles/g de tecido.

3.8 Análise Estatística

Os dados foram expressos como média _{ erro padrão da média (EPM). Para} comparação múltipla dos dados paramétricos, foi utilizada a análise de variância (ANOVA) seguida do teste Student Newman-Keuls

Para os dados não-paramétricos, os resultados foram expressos como mediana (mínimo - máximo) e analisados pelos testes de Kruskall-Wallis e Dunns.

O número de animais (n) por grupo experimental foi no mínimo de 6. Valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

4.

RESULTADOS

4.1. Efeito da rutina e quercetina na hipernocicepção mecânica em camundongos submetidos a neuropatia periférica dolorosa induzida pela oxaliplatina.

A hipernocicepção mecânica foi avaliada nas patas traseiras dos camundongos injetados com oxaliplatina (1mg/kg) via endovenosa, num período de 56 dias. Ambos rutina e quercetina aumentaram o limiar mecânico da oxaliplatina. Rutina em todas as doses foi capaz de prevenir a baixa do limiar mecânico a partir do 28th dia mostrando um efeito melhor na dose de 100mg/kg até 25,5% (p<0,05) no 42º dia de tratamento (Fig.110A). A quercetina também inibiu o efeito da oxaliplatina em todas as doses, aumentando o limiar mecânico a partir do 21th dia, mostrando um melhor efeito na dose de 50 mg/kg com até 91% de efeito máximo no 56º dia de tratamento

(Fig.11B).

4.2. Efeito da rutina e quercetina na alodínia térmica ao frio em camundongos submetidos a neuropatia periférica dolorosa induzida pela oxaliplatina.

A alodínia ao frio (10º) foi avaliada pelo teste da imersão em água fria, da cauda de camundongos injetados por via i.v. oxaliplatina (1mg/kg) durante um período de 56 dias. Nossos resultados mostraram que a oxaliplatina reduz o limiar de retirada da cauda e que ambos os tratamentos com rutina e quercetina, foram capazes de prevenir este efeito. A rutina somente na dose de 50 e 100 mg/kg alcançou um efeito inibitório significante na alodínia ao frio induzida pela oxaliplatina, alcançando o máximo efeito com a dose de 50 mg/kg no 42º dia aumentando o limiar em 555% (p<0,01) quando comparado ao grupo controle (Fig.12A). O tratamento com quercetina em todas as doses, foi capaz de prevenir a alodínia ao frio a partir do 7º dia, aumentando o limiar em 466% (p<0,001), máximo efeito na dose de 50 mg/kg no 49º dia, quando comparado ao grupo controle (Fig.12B).

0 7 14 21 28 35 42 49 56 8 9 10 11 12 Salina + OXL Rutina (25 mg/kg) + OXL Rutina (50 mg/kg) + OXL Rutina (100 mg/kg) + OXL * * _** *** ** ** ** *** * *** *** _*** A Tempo (dias) L im ia r d e re tir ad a d a p at a (g )

Figura 11. Efeito inibitório da rutina e quercetina na hipernocicepção mecânica plantar induzida pela oxaliplatina em camundongos. Os camundongos foram

tratados com 2 injeções por semana de OXL i.v. (1mg/kg) durante quatro semanas e meia, no total de 9 injeções de OXL. Rutina (painel A) ou quercetina (painel B) foi injetado via i.p. 30 min antes da administração de OXL. No grupo controle foi administrado salina em vez de rutina ou quercetina. O teste da hipernocicepção mecânica foi feito antes e a cada 7 dias depois de começar cada tratamento. Os pontos representam a média + E.P.M. (seis animais) do limiar de retirada da pata em gramas (g). *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. ANOVA seguido pelo Student Newman- Keul. 0 7 14 21 28 35 42 49 56 0 5 10 15 Salina + OXL Quercetina (25 mg/kg) + OXL Quercetina (50 mg/kg) + OXL Quercetina (100 mg/kg) + OXL # *** *** *** ** *** *** ** *** *** *** *** *** ## * ** * # B Tempo (dias) L im ia r d e re tir ad a d a p at a (g )

0 7 14 21 28 35 42 49 56 0 20 40 60 80 100 120 140 _{Salina + OXL} Rutina (25 mg/kg) + OXL Rutina (50 mg/kg) + OXL Rutina (100 mg/kg) + OXL ** ** ** ** ** A Tempo (dias) T em p o d e re tir ad a d a ca u d a (s ) 0 7 14 21 28 35 42 49 56 0 50 100 150 Salina + OXL Quercetina (25mg/kg) + OXL Quercetina (50mg/kg) + OXL Quercetina (100 mg/kg) + OXL * ** * ** *** *** *** *** * *** ** *** *** *** *** *** *** B Tempo (dias) T em p o d e re tir ad a d a ca u d a (s )

Figura 12. Efeito da rutina e quercetina sobre a alodínia ao frio (10º) em camundongos tratados com OXL. Camundongos foram tratados com duas

injeções por semana de OXL i.v. (1mg/kg) durante quatro semanas e meia, no total de 9 injeções de OXL. Rutina (Painel A) ou quercetina (Painel B) foi injetado via i.p. 30 min antes da administração de OXL. O grupo controle foi administrado com salina em vez de rutina ou quercetina. O teste térmico (teste da imersão da cauda) foi feito antes e a cada 7 dias depois de começar cada tratamento. Os pontos representam a média + E.P.M. (seis animais) do tempo de reação em segundos, depois da imersão da cauda em água fria. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. ANOVA seguido de Student Newman-Keul.

4.3. Análise histopatológica do corno dorsal da medula espinhal de camundongos submetidos a neuropatia periférica dolorosa induzida pela oxaliplatina e tratados com rutina e quercetina.

A análise histopatológica mostrou diferenças entre os camundongos normais e os tratados com oxaliplatina. Vinte e quatro horas depois de injeção de oxaliplatina, foi observado a presença de espaços lacunares entre as células neuronais, sugerindo edema do tecido nervoso. Nós também observamos uma diminuição progressiva no tamanho dos neurônios, a partir do dia 14, sugerindo uma atrofia de neurônios e aumento do número de células da glia. Ambos rutina e quercetina previnem estas mudanças mantendo o tecido com um aspecto similar ao grupo normal (Fig.13).

4.4. Análise histopatológica da pele recolhida das patas dos camundongos submetidos neuropatia periférica dolorosa induzida pela oxaliplatina e tratados com rutina e quercetina.

Na análise histopatológica da pele da pata do camundongo injetado com oxaliplatina, mostra a presença de espaços lacunares entre as fibras do colágeno, sugerindo um discreto edema do tecido conjuntivo, sem qualquer outro sinal de processo inflamatório. Este edema parece ser mais evidente na primeira semana de tratamento com oxaliplatina. Ambos rutina e quercetina previnem o desenvolvimento destes eventos (Fig 14).

Figura 13. Fotomicrografias do corno dorsal da medula espinhal de camundongos submetidos neurotoxicidade da oxaliplatina (OXL) e tratados com rutina (RUT) ou quercetina (QT). Camundongos foram tratados com duas injeções por semana de OXL i.v.

(1mg/kg) durante 4,5 semanas. RUT ou QT (50mg/kg) foi injetada via i.p. 30 min antes da administração de OXL. O grupo controle foi administrado com salina em vez de RUT ou QT Hematoxilina & Eosina 400x.

Figura 14. Fotomicrografias da pele retirada das patas de camundongos submetidos a neurotoxicidade da oxaliplatina (OXL) e tratados com rutina (RUT) ou quercetina (QT).

Camundongos foram tratados com duas injeções por semana de OXL i.v. (1mg/kg) durante 4,5 semanas. RUT ou QT (50mg/kg) foi injetado via i.p. 30 min antes da administração de OXL. O grupo controle foi administrado salina em vez de RUT ou QT. Hematoxilina & Eosina – 400x.

4.5. Efeito da rutina e quercetina na peroxidação lipídica induzida pela oxaliplatina, nos níveis de malonyaldeido (MDA) e grupos sulfidrílicos não protéicos (NP-SH).

Aos 14 dias de tratamento com oxaliplatina, foi evidenciado um aumento da peroxidação lipídica, avaliada pelo experimento do MDA. A figura 15A mostra que a oxaliplatina induziu uma significante (p<0,05) peroxidação lipídica aumentando em torno de 110,1% os níveis de MDA nas amostras de medula espinhal, quando comparado aos camundongos naïve. Este efeito foi prevenido (p<0,05) por ambos tratamentos com rutina (65,1%) e quercetina (52,7%). Em relação ao nível de grupos sulfidrílicos não protéicos (NP-SH), a oxaliplatina promoveu uma redução, sem diferenças estatísticas entre os grupos experimentais. O tratamento com rutina e quercetina não modificou este efeito (Fig.15B)

Naive S Rutina Quercetina 0 500 1000 1500 2000 2500 Oxaliplatina * _* #

A

Naive S Rutina Quercetina Oxaliplatina

B

##

Figura 15. Efeito da rutina e quercetina nos níveis de malondialdeído (MDA) e grupos sulfidrílicos não protéicos (NP-SH) na medula espinhal. Camundongos

foram tratados com duas injeções por semana de salina, oxaliplatina (1mg/kg) i.v., total de 9 injeções) sozinha ou em combinação com rutina (50mg/kg i.p.) ou quercetina (50mg/kg,i.p.) 30 min antes da administração de oxaliplatina e foram sacrificados no 14º dia depois da 1ªdose. Uma porção da medula espinhal foi coletada e processada para a mensuração do MDA (Painel A) ou níveis de NP-SH (Painel B). Os resultados estão apresentados como a média + EPM. *p<0,05 vs grupo salina, #p<0,05 vs grupo naïve. ANOVA seguido de Student Newman-Keul. ##p<0,01 vs grupo naïve (Teste t-student).

4.6. Análise imunohistoquímica do corno posterior da medula espinhal de camundongos submetidos e neuropatia periférica dolorosa induzida pela oxaliplatina e tratados com rutina e quercetina.

A análise imunohistoquímica mostrou um aumento na imunoexpressão de c- fos, nitrotirosina e iNOS, a qual foi caracterizada pelas células com coloração marrom no corno dorsal da medula espinhal em camundongos submetidos a neuropatia dolorosa induzida pela oxaliplatina (Tabela 5) Fig.16,17,18). A análise imunohistoquimica da c-fos mostrou uma intensa e significante expressão (p<0,01;

Tabela 5) das células neuronais especialmente na região do núcleo (Fig.16B) e

quando comparado aos animais normais (Fig.16A). Ambas rutina (Fig.16C) e quercetina (Fig.16D) inibiram significantemente este efeito (p<0,001) e p<0,01, respectivamente; Tabela 5). A análise imunohistoquímica da nitrotirosina mostrou uma intensa e significante expressão (p<0,01; Tabela 5) das células neuronais especialmente a nível citoplasmático (Fig.17B) quando comparado ao grupo normal (Fig.17A). A quercetina (Fig.17D) mas não a rutina (Fig.17C) inibiu significantemente este efeito (p<0,05; Tabela 5). A análise imunohistoquímica da iNOS mostrou uma intensa e significante expressão (p<0,01; Tabela 5) das células neuronais especialmente a nível de citoplasma (Fig.18B) quando comparado ao grupo normal (Fig.18A). A quercetina (Fig.18D) mas não a rutina (Fig.18C) inibiu significantemente este efeito (p<0,01; Tabela 5).

Tabela 5: Efeito da Rutina e Quercetina na imunoexpressão da c-FOS, iNOS e Nitrotirosina no corno dorsal da medula espinhal de camundongos submetidos neuropatia dolorosa induzida pela oxaliplatina.

Camundongos foram tratados com duas injeções por semana de OXL i.v. (1mg/kg) durante quatro semanas e meia, no total de 9 injeções de OXL. Rutina (RUT) ou quercetina (QT), 50mg/kg foi injetado via i.p. 30 min antes da administração de OXL. O grupo controle foi administrado com salina (OXL+salina) em vez de rutina ou quercetina. Naïve são animais não tratados. Os dados são registrados como mediana dos escores e variação dos escores para no mínimo 5 camundongos por grupo. **p<0,01 comparado com grupo naïve; # p<0,05, ## p<0,01, ### p<0,001 comparado com grupo OXL+Salina (teste Kruskal-Wallis seguido pelo teste Dunn’s).

C-Fos

Nitrotirosina

NOSi

Naïve

1 (0-2)

1 (1-2)

0,5 (0-1)

OXL+ Salina 3 (2-3)**

3 (2-3)**

2 (2-3)**

OXL + RUT 1 (0-1)

_{2 (1-3)}

_{1 (0-2)}

OXL + QT

1 (0-1)

1 (1-2)

1 (0-1)

Figura 16. Fotomicrografias da imunoexpressão para c-Fos no corno dorsal da medula espinhal de camundongos submetidos a neurotoxicidade da oxaliplatina (OXL) e tratados com rutina (RUT) ou quercetina (QT).

Camundongos foram tratados com duas injeções por semana de OXL i.v. (1mg/kg) durante quatro semanas e meia, no total de 9 injeções de OXL. Rutina ou quercetina (50mg/kg) foi injetado via i.p. 30 min antes da administração de OXL. O grupo controle foi administrado com salina em vez de rutina ou quercetina. A: Animais

naïve; B: Oxaliplatina mais salina; C: Oxaliplatina mais rutina (50mg/kg) e D:

Figura 17. Fotomicrografias da imunoexpressão para nitrotirosina no corno posterior da medula espinhal de camundongos submetidos a neurotoxicidade da oxaliplatina (OXL) e tratados com rutina (RUT) ou quercetina (QT).

Camundongos foram tratados com duas injeções por semana de OXL i.v. (1mg/kg) durante quatro semanas e meia, no total de 9 injeções de OXL. Rutina ou quercetina (50mg/kg) foi injetado i.p. 30 min antes da administração de OXL. O grupo controle foi administrado com salina em em vez de rutina ou quercetina. A: Animais naïve; B: Oxapliplatina mais salina; C: Oxaliplatina mais rutina (50mg/kg) e D: Oxaliplatina mais quercetina (50mg/kg). 400x.

Figura 18. Fotomicrografias da imunoexpressão para iNOS no corno dorsal da medula espinhal de camundongos submetidos a neurotoxicidade da oxaliplatina (OXL) e tratados com rutina (RUT) ou quercetina (QT).

Camundongos foram tratados com duas injeções por semana de OXL i.v. (1mg/kg) durante quatro semanas e meia, no total de 9 injeções de OXL. Rutina ou quercetina (50mg/kg) foi injetado via i.p. 30 min antes da administração de OXL. O grupo controle foi administrado com salina em vez de rutina ou quercetina. A: Animais

naïve; B: Oxaliplatina mais salina; C: Oxaliplatina mais rutina (50mg/kg) e D:

5. DISCUSSÃO

A neuropatia periférica dolorosa, que parece ser causada por todos os compostos platinos usados na quimioterapia do câncer, permanece um desafio na prática clínica. Entre estes compostos, a oxaliplatina uma droga de 3ª geração desta classe, que é a primeira linha de tratamento do câncer colorretal, desenvolve uma neuropatia aguda e crônica que é dolorosa e de difícil tratamento. A fase aguda afeta quase todos os pacientes recebendo a droga, e a crônica é dose cumulativa e seu efeito limita o tratamento. Este efeito colateral da oxaliplatina tem sido estudado durante estes últimos anos, mas o mecanismo completo é ainda inconclusivo e o tratamento eficaz ainda não existe.

Visto que a neurotoxicidade, funciona como uma idéia chave para o estudo da toxicidade dose-limitante, tem havido esforços consideráveis para desenvolver abordagens de neuroproteção para prevenir ou pelo menos aliviar a neurotoxicidade induzida pela oxaliplatina. Segundo PARK et al (2011) a neuroproteção envolve a recuperação dos componentes do sistema nervoso, incluindo células, redes funcionais e estruturas (VAJDA,2002). Alguns estudos clínicos vêm sendo desenvolvidos no sentido de avaliar a eficácia de agentes neuroprotetores e recentemente metodologias mais objetivas que avaliam também os aspectos neurofisiológicos vem sendo aplicadas.

Segundo PARK et al (2011) faltam conhecimentos claros sobre os mecanismos fisiopatológicos que contribuem para a neurotoxicidade induzida pela oxaliplatina, ficando assim improvável que estratégias neuroprotetivas sejam desenvolvidas principalmente a curto prazo.

Segundo Peltier e Russel (2002), a neuropatia causada por outros quimioterápicos como paclitaxel e vincristina, já estão bem documentadas na literatura, com modelos desenvolvidos para seu estudo. Porem a neuropatia induzida pela oxaliplatina ainda é pouco estudada, existindo poucos modelos animais para a sua investigação. Neste trabalho nós propomos um efeito preventivo e terapêutico para os flavonóides rutina e quercetina no modelo de neuropatia periférica dolorosa induzida pela oxaliplatina em camundongos.

Um estudo anterior realizado em ratos, Ling et al (2007a) mostrou que o tratamento com oxaliplatina desenvolve uma dolorosa e duradoura neuropatia demonstrada por testes mecânicos e térmicos. Eles usaram as doses de 1, 2 e 4 mg/kg de oxaliplatina em repetidas administrações por via endovenosa.

Outro trabalho utilizou o mesmo protocolo de Ling et al (2007a) em camundongos onde o modelo foi reproduzido e modificado (Pontes 2009). Nesse estudo foram realizados os testes de hipernocicepção mecânica e testes térmicos (teste da imersão da cauda) em temperatura fria (10ºC) ou quente (42ºC) não nociva (para verificar o desenvolvimento de alodínia térmica) e em temperatura fria (4ºC) ou quente (46ºC) nociva (para verificar o desenvolvimento de hiperalgesia térmica) utilizando-se as doses de 1, 2, e 4mg/kg. Do resultado de todos os testes, foi concluído que a dose de 1 mg/kg foi a mais eficaz dentre as outras (dados não mostrados). Baseado nessas evidências, nós escolhemos esta dose para investigar o efeito dos flavonóides e seu mecanismo de ação.

Nos experimentos comportamentais, nós mostramos que ambos rutina e quercetina são capazes de inibir a hipernocicepção mecânica nas patas traseiras dos camundongos submetidos a esta neuropatia. Também o efeito foi observado na alodínia ao frio pelo teste da imersão da cauda. Nós observamos que nestes experimentos a quercetina demonstrou um melhor efeito que a rutina. Supomos que o efeito neurotóxico da oxaliplatina seja realmente sobre o sistema sensitivo. Não fizemos testes para investigar o envolvimento do sistema nervoso motor, mas anteriormente Ling et al., (2007ª) realizou a avaliação da toxicidade geral em ratos tratados com oxaliplatina incluindo a atividade motora que foi monitorizada durante 7 dias e também um teste para avaliar a força motora “Grip Strength test”. Além disso, Pontes (2008) realizou o teste de “rota-rod” em camundongos para avaliação de equilíbrio e coordenação motora para descartar esse tipo de comprometimento.

A imunoexpressão de c-Fos nos neurônios do corno posterior da medula espinhal corrobora a idéia que existe uma ativação de uma via nociceptiva pela oxaliplatina, já que os neurônios do corno posterior demonstraram uma maior expressão para c-Fos no grupo tratado com oxaliplatina. Rutina e quercetina inibiram a expressão para c-Fos sugerindo um efeito antinociceptivo destes flavonóides, além dos resultados dos experimentos comportamentais.

Diversos estudos da literatura utilizam a expressão de c-Fos como uma ferramenta para demonstrar a presença de neurônios nocirresponsivos especialmente na medula espinhal (BULLITT E. et al., 1992; CINTRA; MOLANDER; FUXE, 1993; HERDEGEN et. al, 1994; MORGAN; GOGAS; BASBAUM, 1994; BULLITT, 1989). GOGAS et al. (1991) comenta que a imunohistoquímica da proteína Fos pode ser utilizada como um meio de monitorar a atividade de grandes populações neuronais, em resposta a estímulos nocivos persistentes e Presley et al. (1990) mostrou que há forte correlação entre o comportamento gerado pela dor e o número de células que expressam a proteína Fos. O assunto foi discutido, na revisão apresentada por Harris em 1998. Além disso, a proteína Fos parece não ser produzida por células gliais, ependimais ou endoteliais (MUGNAINI et al., 1989). De nosso conhecimento, ate a presente data, não encontramos trabalhos na literatura associando a hiperalgesia e alodinia da oxaliplatina à expressão de c-fos na medula espinhal de modo semi-quantitativo e nem a inibição por rutina e quercetina dessa expressão.

Com relação aos aspectos morfológicos da medula espinhal foi observado que os animais tratados com oxaliplatina apresentaram mudanças evidenciadas na analise histopatológica como diminuição do corpo celular neuronal, aumento do numero de células gliais e o aparecimento de espaços lacunares no entre as células neuronais. Esses aspectos foram avaliados na área do corno dorsal da substância cinzenta da medula que é reconhecido como sendo o local de sinapse e onde se encontram os corpos celulares dos neurônios de projeção que fazem parte da via antero-lateral do sistema somestésico. Outros autores mostraram que outro composto platino, cisplatina, causa dano ao DNA nuclear neuronal assim como vacuolização mitocondrial (EASTMAN 1987, WINDEBANK; GRISOLD, 2008; PODRATZ et al., 2011). Outro trabalho mostrou que em 144 horas de tratamento com cisplatina, mudanças morfológicas foram observadas, como a diminuição no tamanho dos neurônios, assim como a vacuolização mitocondrial extensiva em todo o corpo celular, enquanto a membrana nuclear permaneceu intacta (PODRATZ et

al., 2011). Recentemente Xiao, Zheng e Bennett (2011) publicaram um estudo

comparando a neuropatia periférica induzida por oxaliplatina com a induzida por paclitaxel. Nesse artigo eles discutem o efeito da oxaliplatina sobre as mitocôndrias