Clarity Tekniğinin Uygulanması

Clarity tekniğinin uygulanması sırasında kullanılacak olan hidrojel ve clearing solüyonları deneme öncesinde taze olarak hazırlandı. Hidrojel solüsyonunun hazırlanmasında kullanılacak kimyasalların (akrilamid, bisakrilamid, PFA) toksik olmaları sebebiyle hazırlama öncesinde kişisel koruyucu ekipmanlar giyildi ve solüsyon çeker ocak altında hazırlandı. Hidrojel solüsyonun hazırlanmasında kullanılacak 10XPBS ve %16 PFA solüsyonları ayrıca hazırlandı. 10X PBS solüsyonunun hazırlanması için 1 adet PBS tablet 20 ml dH2O içerisinde tablet çözülünceye dek karıştırıldı. %16 PFA solüsyonunun hazırlanması için 8 g PFA tartılarak 50 ml dH2O içerisine eklendi ve opak beyaz renk alana dek 60-65°C’ye kadar ısıtıldı. Renk berrak hale gelene dek 1 N NaOH solüsyonu damlatıldı. Solüsyon oda sıcaklığına geldikten sonra filtre ederek kullanıma hazır hale getirildi. Hazırlanan her iki solüsyonun pH’ları ölçülerek uygun aralıklara getirildi.

Hidrojel solüsyonu 400 ml olacak şekilde stok olarak hazırlandı. Hidrojel solüsyonunun hazırlanması sırasında polimerizasyon oluşumunu engellemek için kullanılacak kimyasallar buz üzerine konuldu. Karıştırıcı üzerine alınan 500 ml’lik erlene 150 ml dH2O koyuldu. Üzerine hızla 40 ml %40 akrilamid ve 10 ml %2 bisakrilamidi sırasıyla pipetlenerek eklendi. Önceden hazırlanmış olan %16 PFA’dan 100 ml, 10XPBS’den 40 ml eklenerek orta hızla karıştırmaya devam edildi. Karışmakta olan solüsyona 1g azo-başlatıcı eklendi. Hazırlanan solüsyon mezüre alınarak 400 ml hacmine ulaşana dek dH2O eklendi. Buz üzerinde hazır olan 50 ml'lik falkonlara 40 ml olacak şekilde solüsyonu paylaştırıldı. Aliquotlanan falkonların kapakları sıkıca kapatıldı ve üzerleri parafilm ile kaplanarak -20 ºC'ye kaldırıldı.

Clearing solüsyonun hazırlanmasında kullanılan sodyum SDS’in de toksik olması sebebiyle clearing solüsyonu hazırlanması sırasında da kişisel koruyucu ekipmanlar giyildi ve solüsyon çeker ocak altında hazırlandı. Karıştırıcı üzerine alınan 2000 ml’lik behere 1600 ml dH2O konuldu. İçerisine 80g SDS, 24.73g borik asit eklendi ve karışım homojen hale gelene dek karıştırıldı. Homojen hale gelen solüsyonun pH’sı sodyum hidroksit ile 8,5’e ayarlandı. Solüsyon mezüre alarak hacmi 2000 ml’ye tamamlandı. Cam şişeye alınan solüsyon oda sıcaklığında kullanılana dek bekletildi.

Clarity tekniği uygulanacak olan Sprague Dawley cinsi yetişkin sıçanlar intraperitoneal olarak uygulanan ketamin (100 mg/kg) ve ksilazin hidroklorid (10 mg/kg) ile derin anestezi altına alındı ve ekstremitesine ağrılı uyaran verilerek refleksleri kontrol edildi. Sıçanlar çeker ocak altında, düz bir zeminde buz üzerine yatırılarak perfüzyona hazır hale getirildi. Perfüzyon öncesinde daha önceden aliquotlanmış dondurulmuş hidrojel monomer çözeltisi polimerizasyonu engellemek için buz üzerinde çözdürüldü. Çözelti tamamen eridiğinde hafifçe ters çevirerek karıştırıldı ve çözeltide hava kabarcığı veya çökelti olmadığından emin olundu. Eriyen hidrojel solüsyonundan

perfüzyonda kullanılmak üzere 20 ml enjektör içerisine çekildi ve enjektör buz içerisine konuldu. Falkonda kalan 20 ml solüsyon ise hidrojel inkübasyonunda kullanılmak üzere +4ºC’ye kaldırıldı. Önceden hazırlanmış 20 ml 1XPBS de enjektöre çekilerek perfüzyon öncesi +4°C’ye getirildi. Perfüzyona 20 ml 1XPBS (pH 7,4) ile başlandı ve 20 ml hidrojel solüsyonu ile devam edildi. Solüsyonların her biri yaklaşık iki dakika süre içerisinde verildi. Perfüzyonun tamamlanmasının ardından giyotin aracılığıyla ötenazi yapıldı. Yine buz üzerinde beyinler hızlıca çıkartıldı ve içerisinde 20 ml hidrojel solüsyonu olan falkona konuldu. Falkonun kapağı kapatıldı ve floroforu engellemek için falkon alüminyum folyo ile kaplandı. Hidrojen solüsyonunun doku içine daha fazla difüze olması için +4 ºC'de 2 gün inkübe edildi. İnkübasyon sonrasında hidrojel doku gömülmesinin (polimerizasyon) başlatılması için polimerizasyon oluşumunu engelleyecek oksijen ortamdan uzaklaştırıldı (degassing). Bunun için boş bir enjektör içerisine hidrojel inkübasyonu tamamlanan beyin konuldu ve içerisine bir miktar zeytinyağı çekildi. Enjektörün ucu kapatılarak parafilm ile kaplandı ve sıcaklığı 42C’ye ayarlanmış olan su banyosu içerisine yerleştirildi. Su banyosunun içerisine, içerisinde sadece hidrojel solüsyonu bulunan ayrı bir enjektör de konuldu. Bu sayede içerisinde sadece hidrojel solüsyonunun bulunduğu enjektörde polimerizasyon tamamlandığında diğer enjektörde bulunan doku içerisinde de polimerizasyonun tamamlandığı teyit edildi. Polimerizasyonun tamamlanmasının ardından sürecin son basamağı olan clearing basamağına geçildi.

Clearing basamağı TÜBİTAK 114S407 nolu proje ekibimiz tarafından tasarlanan kompakt organ elektroforez sistemi (CORES) ile yapıldı. Clearing basamağı için CORES içerisine alınan beyin, clearing solüsyonunda yaklaşık 37C ve 0-3 A arasında değişen bir akım altında 48 saat süre boyunca elektroforeze tabi tutuldu. Clearing sonrası şeffaf hale getirilen beyin dokusu yaklaşık 3 mm kalınlığında sagittal olarak dilimlendi. İmmünohistokimyasal boyama öncesinde dokudan fazla SDS’in uzaklaştırılması için beyin dilimleri tritonlu fosfat tamponlu salin (1XPBS içinde 0,1% TritonX-100) solüsyonu içerisinde oda sıcaklığında gece boyu inkübasyona bırakıldı. Bu inkübasyon ertesi gün solüsyon değiştirilerek tekrar edildi. İnkübasyonların tamamlanmasından sonra dopaminerjik nöronların bulunduğu mesencephalon’u içeren kesitlere TH boyaması yapıldı. Kesitler %0,1Triton X-100, %5 keçi serumu, %0.05 sodyum azit içeren 0.01M PBS solüsyonu ile dilüe edilen TH primer antikoru (1:1000) içerisinde oda sıcaklığında 3 gün inkübe edildi. Primer inkübasyon sonrası kesitler birkaç defa (3 dakika, 3 tekrar) PBS ile yıkamayı takiben, %1 keçi serumlu 1XPBS ile dilüe edilmiş FITC konjuge TH sekonder antikoru (1:1000) içerisinde oda sıcaklığında 4 saat inkübe edildi. Kesitler bir kaç defa 1XPBS ile yıkandı ve görüntüleme öncesi dokunun refraksiyon indeksinin eşitlenmesi için %80 gliserol solüsyonuna alınarak 48

saat inkübe edildi. İnkübasyon sırasında floresan kaybının önlenmesi için alüminyum ile kaplanarak ışıktan korundu. Multifoton mikroskobunda kesitlerin incelenmesinin konvansiyonel mikroskoplardan farklılık göstermesi sebebiyle, kesitlerin incelenebilmesi için dokunun hava ile teması kesileceği bir havuz oluşturularak görüntü alındı.