4.1 Transfekte Hücrelerin Seçilimi
Đnsan NSCLC hücre dizileri PC-14’ler, materyal ve metot kısmında anlatıldığı gibi tet6 ve tet4 vektör sistemleri ile birlikte transfekte edilmişlerdir. Transfeksiyon işleminden 24 saat sonra besiyerine blastosidin (100µg/ml) ve zeosin (10 µg/ml) ile muamele edilerek seleksiyona başlanmıştır. Üç günde bir besiyeri tazelenmek süretiyle seleksiyona 26 gün devam edilmiştir. Transeksiyon işleminden 26 gün sonra boş vektör, PTENwt, PTENG129R ve PTENG129E ifade ettiğini düşündüğümüz koloniler belirmişlerdir (Şekil 4.1). PTEN wt, PTENG129R ve PTENG129E transfekte edilen PC 14 hücrelerinde PTEN ekspresyonunu tekrardan yaratıp yaratmadığını anlayabilmek için western blot analizi yapılmıştır.
4.2 Transfekte Hücrelerde PTEN Đfadesinin Gösterilmesi
Teton sistemi iki vektörden oluşmaktadır. Bunlardan tet6 vektörü blastosidin direnç geni taşırken, tet4 vektörü zeosin direnç geni taşımaktadır. Koloni seçilimi, blastosidin ve zeosin seçilim markerları ile gerçekleştirilmiştir. PC 14 NSCLC hücre dizisine transfekte ettiğimiz tet6 vektörü, sürekli olarak represör ifade etmektedir (TetR). TetR, tet4 vektörünün promotorunu baskılamaktadır. Bu baskıyı ortadan kaldırmak için hücreler tetrasiklin ile muamele edilir. Tetrasiklin, TetR’a bağlanarak tet4 vektörünün promotorunun baskılanmasını inhibe eder. Bu sayede klonlanan PTEN gen ifadesi sağlanır (Şekil 4.2)
Şekil 4.2 TETON sisteminin çalışma mekanizması
Boş vektör, PTENwt, PTENG129R ve PTENG129E transfekte edilen PC14 hücrelerinden RIPA buffer ile elde edilen lizatlar bu hücrelerde PTEN ifadesinin varlığını göstermek ve TETON sisteminin düzgün çalışıp çalışmadığını anlamak amacı ile western blot analizine tabi tutuldular.
Boş vektör, PTENwt, PTENG129R ve PTENG129E transfekte edilen PC 14 hücreleri 2 µ g/ml tetrasiklin ile muamele edilen ve edilmeyen iki gruba ayrılarak 24 saat inkübe edilmiştir. Đnkübasyon sonrası RIPA buffer ile hücreler lize edildiler. “Materyal metod bölümde” anlatıldığı gibi bradford yöntemi ile protein miktarı tayin edildi. Bu lizatlar, her well’de 100 µg protein olacak şekilde SDS-jel (%4-20 gradientli) elektroforezine tabi tutuldular (Tablo 4.1). Elektroforez işleminin ardından jeldeki proteinler immünobolin blota transfer edildiler. PTEN’e karşı yapılan işaretleme transfektant PC 14 hücrelerinin PTEN wt ve mutantlarını eksprese ettiğini göstermektedir (Şekil 4.3). Aynı sonuç bize PTEN ekpresyonun sadece tetrasiklin varlığın da olduğunu da gösterir.
Tablo 4.1 Hücre Protein ÖrneklerininSDS-PAGE için Hazırlanması Protein
Konsantrasyonu (µg/ml)
100 µg protein için alınan lizat (µl) PBS (µl) 2X lamelli buffer (µl) PC14 tet4/6 16,22 6,17 3,83 10 PC14 tet4/6 tetrasiklin 19,32 5,17 4,83 10 PTEN wt 17,21 5,81 4,19 10 PTEN wt tetrasiklin 11,89 8,41 1,59 10 PTENG129R 15,14 6,61 3,39 10 PTENG129R tetrasiklin 11,96 8,36 1,64 10 PTENG129E 16,26 6,15 3,85 10 PTENG129E tetrasiklin 18,47 5,41 4,59 10
Şekil 4.3 Boş vektör, PTENwt, PTENG129R ve PTENG129E transfekte edilen PC 14 hücrelerinin PTEN ve GAPDH ekspresyonları
SDS-PAGE sırasında protein örneklerin yüklenmesinde hata olup olmadığını göstermek için membran üzerinden PTEN antikoru uzaklaştırılarak (strip off) aynı membran GAPDH antikoru ile tekrar işaretlenmiştir (Şekil 4.3). Boş vektör, PTENwt, PTENG129R ve PTENG129E transfekte edilmiş PC 14 hücrelerinin hepsinde eşit oranda GAPDH ifadesi olduğu gösterilmiştir. Bu da sonuçta protein yüklemesinin well’lere eşit miktarda yapıldığını gösterir.
4.3. Tekrar Yaratılan PTEN Đfadesinin Hücre Đnvazyonuna Etkisi
Boş vektör, PTENwt, PTENG129R ve PTENG129E transfekte edilmiş PC 14 hücreleri, matrijel invazyon odacıklarına serum içermeyen besiyeri içerisinde 2,5 X 104 hücre/ml olacak şekilde yerleştirilmiştir. Đnvazyon odacığının dışına ise %10 serum (FBS) içeren besiyeri konulmuştur. Bu deney düzeneğinde hücreler 37°C’de CO2’li
inkübatörde 24 saat inkübe edilmişlerdir. Bu durumda invaziv karakterli hücreler seruma kemoatrak yaparak 8 mm çaplı porlar ile örtülü matrijel matriks ortamından geçmişlerdir. Matrijel matrikste bulunan dolayısıyla invaziv hücreler toludine mavisi (%1) ile boyanarak mikroskop altında 40X büyütmede sayılmışlardır.
Boş vektör transfekte edilen PC 14 hücrelerinin ortalama invazyon sayısı 31.6±2.5 hücre, PTENG129R transfekte edilen PC 14 hücreleri ortalama invazyon sayısı 52.4±7.0 hücre, PTENG129E transfekte edilen PC 14 hücreleri ortalama invazyon sayısı 47.8±8.1 hücre iken, PTEN wt transfekte edilen PC 14 hücrelerinde bu sayı düşerek invaziv hücre sayısı 1.4±0.5 hücre bulunmuştur.
Yüzde invazyonu hesaplayabilmek için hücre migrasyonu da saptamak gerekmektedir. Bu sebeple BD Biosciences firmasından kontrol odacıkları satın alınmıştır. Yüzde invazyon tespit edilmesi amacıyla invazyon deneyinde kullanılan aynı hücreler, aynı ortam koşullarında 2,5 X 104 hücre/ml hücre olacak şekilde kontrol odacıklarına ekilmişlerdir. Bu deney düzeneğinde hücreler 37°C’de CO2’li inkübatörde
24 saat inkübe edilmişlerdir. Kontrol deneyi sonuçları şu şekilde bulunmuştur; Boş vektör transfekte edilen PC 14 hücrelerinin kontrol odacığının diğer tarafına göç eden hücrelerin ortalama sayısı 55±3.8 hücre, PTENG129R transfekte edilen PC 14 hücrelerinin kontrol odacığının diğer tarafına göç eden hücrelerin ortalama sayısı 76.8±5.8 hücre, PTENG129E transfekte edilen PC 14 hücrelerinin kontrol odacığının diğer tarafına göç eden hücrelerin ortalama sayısı 73.6±4.4 hücre iken, PTEN wt transfekte edilen PC 14 hücrelerinin kontrol odacığının diğer tarafına göç eden hücrelerin ortalama sayısı 7.4±0.8 hücre bulunmuştur.
Đnvazyon ve migrasyon deneylerinden elde edilen sonuçlar aşağıdaki formül uygulanarak hücrelerin % invazyon hesaplandı.
matrijel matriks bazal membranındaki hücre sayısı
% Đnvazyon = X 100 Kontrol membranındaki hücre sayısı
Buna göre hücrelerin % invazyonu boş vektör transfekte edilen PC 14 hücrelerinde %57.45±12.7, PTENG129R transfekte edilen PC 14 hücrelerinde % 68.22±14.2,
PTENG129E transfekte edilen PC 14 hücrelerinde % 64.94±14.9 iken PTEN wt transfekte edilen PC 14 hücrelerinde % 18.91±3.2 olarak bulunmuştur (Tablo 4.2), (Şekil 4.4). Kalıcı transfekte edilen PC 14 PTEN wt hücrelerinde ifade edilen PTEN
geni, boş vektör transfekte edilen hücrelere oranla invazyonu %67±3.2 oranında baskılamaktadır (p<0,05).
Tablo 4.2 Hücrelerin Kontrole Oranla Yüzde Đnvazyon
Tet4-6 57.45±12.7
Pten Wt 18.91±3.2
Pten129R 68.22±14.2
Pten129E 64.94±14.9
Şekil 4.4 Yeniden yaratılan PTEN ekspresyonunun hücre invazyona etkisi
4.4. PTEN Đfadesinin Proliferasyona Etkisi
Boş vektör, PTENwt, PTENG129R ve PTENG129E transfekte edilen PC 14 hücreleri, başlangıçtaki sayıları 1 X 103 hücre/ml olacak şekilde 96 kuyucuklu petrilere ekilmiştir. PTEN wt ve mutantlarının ifadelerinin PC 14 hücrelerinin proliferasyona etkisi mtt kit ile 0, 24, 48 ve 72. saatlerde ölçülmüştür. Elde edilen verilerden 0. saatteki ölçüm ile diğer saatteki ölçümler oranlanarak büyüme indüksiyon grafiği elde edilmiştir (Tablo 4.3).
Sıfırıncı saate oranla hücre proliferasyonun kaç kat arttığını saptamak amacı ile 24, 48 ve 72 saat mtt ölçümleri 0. saate oranlandı. Böylece sıfırIncı saate oranla % hücre proliferasyonu saptandı. Buna göre; boş vektör transfekte edilen PC14 hücrelerinin 0, 24, 48 ve 72. saatteki ölçümlerinin proliferasyon sonuçları sırası ile 1±0.10; 1.26±0.12; 1.83±0.12 ve 1.71±0.05 iken PTENG129R transekte edilenler sırası ile 1±0.07; 1.22±0.01; 1.49±0.01 ve 1.65±0.08 olarak bulunmuştur (Şekil 4.5), PTENG129E kalıcı transfekte edilen PC 14 hücrelerinin 0, 24, 48 ve 72. saatteki proliferasyon sonuçları sırası ile 1±0.01; 1.33±0.01; 1.96±0.16 ve 2.06±0.08 olarak bulunurken (Şekil 4.6) PTEN wt kalıcı transfekte edilen PC 14 hücrelerinin 0, 24, 48 ve 72. saatteki ölçümleri ise sırası ile 1±0.03; 1.42±0.13; 1.11±0.01 ve 1.64±0.13 olarak bulunmuştur (Şekil 4.7).
Bu sonuçlar ile yapılan istatistiksel çalışmada tüm gruplar arasında proliferasyon açısından istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunamamıştır (p=0,15; p>0,05).
Tablo 4.3 Hücrelerin Büyüme Đndüksiyon Oranı Büyüme
Đndüksiyon Oranı 0 saat 24 saat 48 saat 72 saat TET4/6 1 ± 0,10 1,263003 ± 0,12 1,839174 ± 0,12 1,713021 ± 0,05 PTEN WT 1 ± 0,03 1,423629 ± 0,13 1,118143 ± 0,01 1,64135 ± 0,13 PTEN129R 1 ± 0,07 1,227626 ± 0,01 1,494964 ± 0,01 1,657842 ± 0,08 PTEN129E 1 ± 0,01 1,332885 ± 0,01 1,964558 ± 0,16 2,064154 ± 0,08
Şekil 4.6 PTEN G129E ifadesinin PC 14 hücre proliferasyona etkisi
4.5 PTEN Đfadesinin Apoptozis Üzerine Etkisi
Boş vektör, PTENwt, PTENG129R ve PTENG129E transfekte edilmiş PC 14 hücrelerindeki PTEN ifadelerinin apoptozis üzerine etkisi de araştırılmıştır. Başlangıçtaki sayıları 1x 104 hücre/ml olan boş vektör, PTENwt, PTENG129R ve PTENG129E transfekte edilmiş PC 14 hücreleri tetrasiklin ile muamele edilen ve edilmeyen iki grup oluşturularak 0, 24, 48 ve 72 saat inkübe edilmiştir. Đnkübasyon süresi sonunda Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) testi uygulanarak apoptotisize uğrayan hücreler belirlenmiştir (Şekil 4.8). Canlı hücreler, apoptotik hücrelere oranlanarak yüzde apoptozis bulunmuştur.
Şekil 4.8 Apoptozise uğrayan PC14 hücreleri kahverengi boyanırken, apoptozise uğramayanlar mavi renkte boyanmaktadırlar
Boş vektör transfekte edilen PC 14 hücrelerinin 0, 24, 48 ve 72. saatteki apoptotik hücre sayıları sırası ile 1.2±0.7; 2.2±0.4; 3.2±0.8 ve 2.6±0.7 olarak saptanmıştır. Apoptotik olmayan normal hücre sayıları ise sırası ile 271±44.6, 310±10.8, 209±34.2 ve 352±35.4 olarak saptanmıştır. Apoptotik hücrelerin normal hücrelere oranı ise %0.004±0.32; % 0.007±0.37; %0.015±0.30 ve %0.007±0.27 olarak bulunmuştur (Tablo 4.4), (Şekil 4.9).
PTENG129R kalıcı transfekte edilen PC 14 hücrelerinin 0, 24, 48 ve 72. saat apoptotik hücre sayıları sırası ile 1±0.6; 2±0.4; 2.2±0.4 ve 2.4±0.7 olarak saptanmıştır. Apoptotik olmayan normal hücre sayıları ise sırası ile 172,4±33.8, 342±30.1, 236,2±35.5 ve 199±22.3 olarak saptanmıştır. Apoptotik hücrelerin normal hücrelere oranı ise %0.006±0.20; %0.005±0.27; %0.01±0.25 ve %0.017±58 olarak bulunmuştur (Şekil 4.9)
PTENG129E kalıcı transfekte edilen PC 14 hücrelerinin 0, 24, 48 ve 72. saat apoptotik hücre sayıları sırası ile 1.2±0.3; 2.4±0.4; 2.4±0.4 ve 3.6±1 olarak saptanmıştır. Apoptotik olmayan normal hücre sayıları ise sırası ile 102±12.5; 192.4±22.9; 247.8±35.5 ve 245.6±22.3 olarak saptanmıştır. Apoptotik hücrelerin normal hücrelere oranı ise %0.011±0.34; %0.012±0.87; %0.09±0.26 ve %0.014±0.46 olarak bulunmuştur (Şekil 4.9).
PTEN wt kalıcı transfekte edilen PC 14 hücrelerinin 0, 24, 48 ve 72. saat apoptotik hücre sayıları sırası ile 1.2±0.4; 2.2±0.7; 3.2±0.4 ve 8.8±2.3 olarak saptanmıştır. Apoptotik olmayan hücre sayıları ise sırası ile 205.2±26.4; 307±22.3; 168.8±4 ve 264.2±33.8 olarak saptanmıştır. Apoptotik hücrelerin normal hücrelere oranı ise ise %0.004±0.14; %0.01±0.45; %0.02±0.42 ve %0.03±1.39 olarak bulunmuştur (Şekil 4.9).
Tablo 4.4 Hücreleri Yüzde Apoptozis Oranları
0 saat 24 saat 48 saat 72 saat
TET4/6 0,00443±0.32 0,00709±0.37 0,01528±0.30 0,00739±0.27 PTEN WT 0,00487±0.14 0,01107±0.45 0,02370±0.42 0,03331±1.39 PTEN129R 0,00624±0.20 0,00585±0.27 0,01016±0.25 0,01709±0.58 PTEN129E 0,01176±0.34 0,01247±0.87 0,00969±0.26 0,01466±0.46
Şekil 4.9 Boş vektör, PTENwt, PTEN G129E ve PTEN G129R transfekte edilen PC 14 hücrelerinin 0.-72. saatler arasında apoptotik hücre sayısının normal hücre sayısına oranı
4.6. PTEN Đfadesinin Koloni Formasyonu Üzerine Etkisi
Başlangıçtaki sayıları 1 X 103 hücre/ml olan boş vektör, PTENwt, PTENG129R ve PTENG129E transfekte edilmiş PC 14 hücreleri 10 cm çaplı petri kaplarına ekilerek 3 hafta boyunca %10 serum (FBS) içeren besiyerinde 37°C’de CO2’li inkübatörde inkübe edilmişlerdir. Bütün hücrelere 2 µ g/ml tetrasiklin hergün ilave edilmiştir. Đnkübasyon süresinin sonunda hücreler metanol ile fikse edilmiş ve toluiden blue boyası ile boyanarak PTEN ifadesinin koloni formasyonuna etkisini anlamak için 0,1 cm’den büyük koloniler sayılmıştır (Şekil 4.10).
Boş vektör transfekte edilen PC 14 hücrelerinin koloni sayısı ortalama 40,6±1.5 iken PTENG129R transfekte edilen PC 14 hücreleri koloni sayısı ortalama 39±2.6, PTENG129E transfekte edilen PC 14 hücreleri koloni sayısı ortalama 40±2 ve PTEN wt transfekte edilen PC 14 hücreleri koloni sayısı ise 13,6±1.5 olarak bulunmuştur (Tablo 4.5), (Şekil 4.11).
Sonuç olarak, PTENG129R ve PTENG129E ifade eden hücrelerin oluşturdukları koloni sayıları boş vektör transfekte edilenler kadar olurken PTEN wt ifadesinin PC 14
hücrelerinin koloni oluşturma yeteneğini yaklaşık % 64 ± 3,53 oranında baskıladığı saptanmıştır (p<0,05).
Tablo 4.5 Hücrelerin Oluşturdukları Koloni Sayıları
Tet4-6 40.6±1.5
Pten wt 13.6±1.5
Pten129R 39±2.6
Pten129E 40±2
Şekil 4.10 Boş vektör, PTENwt, PTENG129R ve PTENG129E transfekte edilmiş PC 14 hücrelerinin koloni fotoğrafları .
Şekil 4.11 Boş vektör, PTENwt, PTENG129R ve PTENG129E transfekte edilmiş PC 14 hücrelerinin koloni sayıları .