PROLIFERAÇÃO
ANTÍGENO%ESPECÍFICA
DAS
SUBPOPULAÇÕES
E DE MEMÓRIA DE LINFÓCITOS T
ESTIMULADOS COM O POOL DE PEPTÍDEOS DO HIV%1 E DO
CMV
Considerando que a capacidade proliferativa de linfócitos T está associada com fenótipo de células T de mémoria e que dados da literatura mostram que a presença de células T CD4+ HIV=específicas capazes de proliferar em resposta a antígenos de HIV está associada ao controle da replicação do HIV=1 (Rosenberg et al., 1997; Rosenberg et al., 2000), investigamos a capacidade de proliferação das subpopulações de células T de memória de pacientes HIV+ em resposta ao de peptídeos de HIV=1 e do CMV. Para a avaliação da capacidade proliferativa, células mononucleares de sangue periférico de seis pacientes HIV+ (A7, A15, A24, A43, A28 e A54) e de um indivíduo controle sadio (CTR 1) foram marcadas com CFSE e em seguida, estimuladas com o de peptídeos do HIV=1 e de peptídeos do CMV por cinco dias. Células em presença apenas de DMSO e células estimuladas com SEB foram utilizadas como controle negativo e controle positivo da reação, respectivamente. As células que proliferaram foram então quantificadas e fenotipicamente caracterizadas por citometria de fluxo. A análise da proliferação por CFSE foi feita através do percentual de células divididas que corresponde à percentagem de células
117 Resultados
da amostra original que se dividiram. Para exemplificar, a Figura 19 mostra os percentuais de proliferação das subpopulações #) e de memória T CD4+ (Figura 19A) e T CD8+ (Figura 19B) obtidos para o paciente A7, quando as células deste indivíduo foram estimuladas com o de peptídeos do HIV=1.
Considerando todos os indivíduos incluídos neste ensaio, de modo geral, observamos a existência de um &( ! variável na condição DMSO. (Tabelas 6).
Na Tabela 6 observamos o percentual de células divididas dentro do compartimento total T CD4+ e T CD8+ em resposta aos " de peptídeos
do HIV=1 e do CMV. Em ambos os compartimentos celulares, para todos os pacientes HIV+ observamos aumento no percentual das células divididas em resposta aos " de peptídeos do HIV=1 e do CMV em comparação à
condição DMSO. Dentro dos compartimentos T CD4+ e T CD8+ totais não houve diferença estatística entre o percentual de células divididas na condição DMSO e esse percentual na condição HIV ou CMV.
Analisamos as células T #) e as subpopulações de células T de
memória que proliferaram em resposta aos " de peptídeos.
Especificamente, dentro do compartimento T CD4+, quando as células dos pacientes HIV+ foram estimuladas com o de peptídeos do HIV=1, observamos um aumento no percentual de células divididas dentro das subpopulações #) e de memória em comparação à condição DMSO para
todos os indivíduos (Anexo 13). O mesmo foi observado para o compartimento T CD8+, com exceção da subpopulação TEM do paciente
Resultados
A28, para a qual não ocorreu aumento no percentual de células divididas na condição HIV versus DMSO (Anexo 13).
Em relação ao estímulo com o de peptídeos do CMV, no compartimento T CD4+, apenas para um de seis pacientes HIV+ dentro das subpopulações TCM e TEM e para dois de seis pacientes HIV+ dentro da subpopulação TEMRA, o percentual de células divididas foi menor que na condição DMSO. No compartimento T CD8+, tal fato também ocorreu para dois de seis pacientes HIV+ dentro da subpopulação TEM (Anexo 13).
Para o indivíduo controle sadio, o percentual de células #) e de
memória divididas na condição HIV foi menor que na condição DMSO ou este percentual foi baixo quando não houve células proliferantes na condição DMSO. Isso também ocorreu quando as células deste indivíduo foram estimuladas com o de peptídeos do CMV, exceto para a subpopulação TCM CD8+, dentro da qual o percentual de células proliferantes na condição CMV foi maior que na condição DMSO (Anexo 13).
É importante ressaltar que para os pacientes HIV+ o percentual de células divididas em resposta ao HIV diferiu estatisticamente do controle DMSO nas subpopulações #) (P = 0,013) e TEMRA (P = 0,021)
no compartimento T CD4+ (Figura 20A), bem como em #) (P = 0,021) e
TEM (P = 0,046) no compartimento T CD8+ (Figura 20B). A resposta proliferativa CMV=específica foi estatisticamente significativa em relação ao controle DMSO apenas dentro da subpopulação #) T CD8+ (P = 0,032) (Figura 20B).
119 Resultados
Em nosso estudo, a marcação das moléculas de superfície CCR7 e CD45RA foi realizada após as células terem permanecido por um período de cinco dias em cultura sob estimulação antigênica, o que pode modificar a expressão dessas e de outras moléculas sobre as subpopulações de linfócitos T de forma dinâmica. Considerando as condições de nosso ensaio de proliferação por CFSE não podemos descartar a possibilidade de que essas células com fenótipo #) possam ter sido ativadas # )#$ e
correspondam a células efetoras. Portanto, ressaltamos que a nomenclatura
“ #) ” aqui adotada diz respeito apenas à expressão concomitante de
CD45RA e CCR7.
Em resumo, observamos que o de peptídeos do HIV=1 e de peptídeos do CMV identificados pelo nosso grupo são capazes de induzir proliferação de subpopulações de linfócitos T com fenótipo de células #)
e de memória de pacientes progressores HIV+. É válido ressaltar que os pacientes cujas células foram incluídas nesse ensaio são de grupos clinicamente diferentes, sendo quatro pacientes AV=ART e dois pacientes VI sem ART. É nosso objetivo expandir esses dados pela inclusão de um número maior de indivíduos HIV+ que nos permita confirmar o potencial de indução de proliferação de nossos peptídeos e comparar as respostas proliferativa entre os diferentes grupos clínicos.
Resultados
T CD4
+ 8,76 5,24 6,31 5,00 10,5 9 12,21 9,70 14,95 6,47 8,77 12,75 3,50 54,63 53,86 41,5 6 20,05121 Resultados
B
Figura 19: Avaliação do percentual de proliferação antígeno%específica de subpopulações de linfócitos T do paciente A7. Aqui são mostrados os
dados representativos da proliferação por CFSE das subpopulações #) e
de memória de linfócitos TCD4+ (A) e T CD8+ (B) do paciente A7 quando estimulados com o HIV, CMV ou SEB. Adicionou=se DMSO ao controle negativo. As PBMC do paciente A7 foram marcadas com CFSE (1,25 gM) e estimuladas com peptídeos por 5 dias para análise da proliferação antígeno=específica. Posteriormente, as células foram marcadas com os anticorpos anti=CD3 APC Cy7, anti=CD4 APC, anti=CD8 PE Cy5, anti= CCR7 PE Cy7 e anti=CD45RA PE. Os números em cada gráfico indicam o percentual de células divididas dentro de cada subpopulação de células T CD4+ e T CD8+.
T CD8
+ 5,72 3,64 7,22 7,99 6,34 6,08 9,22 8,24 5,97 9,78 4,54 9,54 51,8 1 42,03 28,84 15,93Resultados
Tabela 6 % Proliferação por CFSE de linfócitos T CD4+ e T CD8+ totais de pacientes HIV+ e indivíduo controle sadio em resposta aos "
de peptídeos do HIV=1 e do CMV.
TCD4+ TCD8+
DMSO HIV CMV SEB DMSO HIV CMV SEB CTR 1 2,22 1,36 0,84 36,51 0,84 0,53 0,91 38,55 A7 6,68 9,51 7,08 52,88 6,27 7,35 6,33 34,63 A28 6,75 10,16 9,26 30,13 7,35 11,39 9,88 25,08 A15 2,57 5,68 4,64 19,68 1,87 4,77 3,22 21,11 A24 2,76 5,49 3,22 14,04 2,68 5,93 3,39 12,23 A43 4,89 7,64 6,60 21,75 3,94 8,80 6,96 22,42 A54 6,43 14,70 9,03 47,22 7,08 13,96 10,35 17,71
Células dos pacientes HIV+ e controle sadio foram marcadas com CFSE (1,25 gM) e estimuladas com o pool de peptídeos do HIV=1 (5 gM), pool de peptídeos do CMV (5 gM) ou SEB (2 gg/mL) por 5 dias para análise da proliferação antígeno=específica. Adicionou=se DMSO ao controle negativo. Posteriormente, as células foram marcadas com os anticorpos anti=CD3 APC Cy7, anti=CD4 APC, anti=CD8 PE Cy5, anti=CCR7 PE Cy7 e anti= CD45RA PE. Os números indicam o percentual de células divididas dentro dos compartimentos totais T CD4+ e T CD8+. As áreas em azul indicam as subpopulações onde o percentual de células divididas em resposta aos
" de peptídeos do HIV=1, do CMV ou ao SEB superou em pelo menos
123 Resultados % S u b p o p u la ç õ e s T C D 8 + A B
Figura 20: Avaliação do percentual de proliferação de subpopulações de linfócitos T antígeno%específica em células de pacientes HIV+.
Células dos pacientes HIV+ foram marcadas com CFSE (1,25 gM) e estimuladas com o pool de peptídeos do HIV=1 (5 gM) ou pool de peptídeos do CMV (5 gM) por 5 dias para análise da proliferação antígeno=específica. Adicionou=se DMSO ao controle negativo para a caracterização fenotípica
% S u b p o p u la ç õ e s T C D 4 +
Resultados
das subpopulações #) e de memória. (CCR7+CD45RA+); TCM (CCR7+CD45RA=); TEM (CCR7=CD45RA); TEMRA (CCR7=CD45RA+). A barra horizontal indica a mediana. A = T CD4+ e B = T CD8+.