No estudo longitudinal, realizado seis meses após a primeira avaliação, foram reexaminados 177 cães de área periurbana e 36 cães em área rural. Durante o 2ª exame sorológico, com o objetivo de avaliar a dinâmica da infecção canina por Leishmania através da soroconversão e da manutenção de áreas de transmissão da LV, observou-se que em ambiente periurbano 52 cães apresentaram positividade através do antígeno SLA - o que representa um percentual de positividade de 29.4% - dos quais 37 (20.9%) animais, que no primeiro exame não apresentaram presença de anticorpos, no segundo exame produziram títulos positivos de anticorpos anti-Leishmania, e 15 (8.5%) animais que se mantiveram soropositivos nos dois momentos da pesquisa. Um grupo de 39 (22%) apresentou perda de anticorpos em relação ao primeiro exame, tornando-se soronegativos (Tabela 17). Dos cães reexaminados em área rural pelo antígeno SLA, 15 tiveram sorologia positiva, atingindo uma prevalência de 41.7%. Destes, 3 (8.3%) soroconverteram e 12 (33.4%) mantiveram-se positivos nos dois momentos do exame. Oito animais (22.2%) que foram considerados positivos durante a primeira sorologia, encontraram-se negativos após seis meses (Tabela 18).
Tabela 17: Avaliação sorológica, através do antígeno SLA, durante o estudo longitudinal nos cães de área Periurbana
Sorologia 1ª amostra Sorologia 2ª amostra SLA Positivo N (%) SLA Negativo n (%) Total n (%) SLA Positivo n (%) SLA Negativo n (%) Total n (%) 15 (8.5%)a 39 (22%)b 54 (30.5%) 37 (20.9%)c 86 (48.6%)d 123 (69.5%) 52 (29.4%) 125 (70.6%) 177 (100%) Mcnemar, (a/d) p<0.0001; (b/c) p=1.00
Tabela 18: Avaliação sorológica, através do antígeno SLA, durante o estudo longitudinal nos cães de área Rural
Sorologia 1ª amostra Sorologia 2ª amostra SLA Positivo N (%) SLA Negativo n (%) Total n (%) SLA Positivo n (%) SLA Negativo n (%) Total n (%) 12 (33.4%)a 8 (22.2%)b 20 (55.6%) 3 (8.3%)c 13 (36.1%)d 16 (44.4%) 15 (41.7%) 21 (58.3%) 36 (100%) Mcnemar, (a/d) p=1.00; (b/c) p=0.2278
Utilizando o antígeno rK39 não houve soropositividade em ambiente periurbano, e em ambiente rural apenas um animal, que apresentou títulos sorológicos negativo na primeira visita, produziu títulos positivos de anticorpos anti-Leishmania após seis meses, sendo a taxa de soroconversão de 2.8%.
O teste Mcnemar revelou que os percentuais de positividade e negatividade foram estatisticamente diferentes através do SLA (p<0.0001), enquanto que os índices de soroconversão e reversão não foram significativamente diferentes (p=1.00) em área periurbana. Em meio rural, os percentuais de negativos e positivos (p=1.00) e de conversão e reversão
sorológica (p=0.2278) não diferiram estatisticamente. A análise estatística não foi realizada para os testes sorológicos que utilizaram o antígeno rK39 em conseqüência dos resultados obtidos.
A reavaliação sorológica dos animais quanto à expressão da imunoglobulina IgG1 no estudo longitudinal permitiu identificar na população periurbana um percentual de positividade de 1.7% no período de seis meses entre as duas amostras sorológicas, o qual correspondeu à soroconversão. Do percentual de negativos, 15.8% foram de animais que apresentaram reversão sorológica, os demais (82.5%) foram negativos nos dois momentos do exame (Tabela 19). Entre os cães de área rural, a prevalência de IgG1 foi de 8.3%, onde 5.5% foram resultados de soroconversão (Tabela 20). O percentual de cães soronegativos para IgG1 correspondeu a 91.7%; destes, 25% foram resultados de reversão sorológica. A análise estatística, através do teste Mcnemar, considerou significante o percentual de cães negativos em relação aos positivos nas duas áreas pesquisadas (p<0.0001). Porém apenas em meio periurbano o percentual de reversão sorológica foi significativamente maior quando comparado ao de soroconversão (p<0.0001).
Tabela 19: Avaliação sorológica da imunoglobulina IgG1 anti-Leishmania durante o estudo longitudinal dos cães de área Periurbana
Sorologia 1ª amostra
Sorologia 2ª amostra
IgG1 + IgG1 - Total n (%) IgG1 + IgG1 - Total n (%) - 28 (15.8%)b 28 (15.8%) 3 (1.7%)c 146 (82.5%)d 149 (84.2%) 3 (1.7%) 174 (98.3%) 177 (100%) Mcnemar, (b/c) p<0.0001
Tabela 20: Avaliação sorológica da imunoglobulina IgG1 anti-Leishmania durante o estudo longitudinal dos cães de área Rural
Sorologia 1ª amostra
Sorologia 2ª amostra
IgG1 + IgG1 - Total n (%) IgG1 + IgG1 - Total n (%) 1 (2.8%)a 9 (25%)b 10 (27.8%) 2 (5.5%)c 24 (66.7%)d 26 (72.2%) 3 (8.3%) 33 (91.7%) 36 (100%) Mcnemar, (b/c) p=0.0704
Os títulos da imunoglobulina IgG2 anti-Leishmania em área periurbana, no momento do estudo longitudinal, foram considerados positivos em 15.3% dos cães; destes, 2.3% soroconverteram no período de seis meses. Dos animais reavaliados encontrou-se 84.7% de soronegativos; entre eles, 37.8% perderam anticorpos ou desenvolveram reversão sorológica (Tabela 21). Em meio rural, a produção de IgG2 a níveis considerados positivos ocorreu em 55.6% da população, onde calculou-se 2.8% de soroconversão. Os cães IgG2 negativos representaram 44.4%, com índice de 22.2% de reversão sorológica (Tabela 22). O teste Mcnemar considerou significativamente maior o percentual de cães negativos quando comparado ao percentual de cães positivos em área periurbana (p<0.0001). Em área rural ocorreu maior proporção de cães soropositivos, porém não houve associação significativa (0.0543). Por sua vez, os índices de conversão sorológica foram significativamente menores em relação aos de reversão sorológica nas duas populações de estudo.
Tabela 21: Avaliação sorológica da imunoglobulina IgG2 anti-Leishmania durante o estudo longitudinal dos cães de área Periurbana
Sorologia 1ª amostra
Sorologia 2ª amostra
IgG2 + IgG2 - Total n (%) IgG2 + IgG2 - Total n (%) 23 (13%)a 67 (37.8%)b 90 (50.8%) 4 (2.3%)c 83 (46.9%)d 87 (49.2%) 27 (15.3%) 150 (84.7%) 177 (100%) Mcnemar, (b/c) p<0.0001
Tabela 22: Avaliação sorológica da imunoglobulina IgG2 anti-Leishmania durante o estudo longitudinal dos cães de área Rural
Sorologia 1ª amostra
Sorologia 2ª amostra
IgG2 + IgG2 - Total n (%) IgG2 + IgG2 - Total n (%) 19 (52.8%)a 8 (22.2%)b 27 (75%) 1 (2.8%)c 8 (22.2%)d 9 (25%) 20 (55.6%) 16 (44.4%) 36 (100%) Mcnemar, (b/c) p=0.0455
A realização do estudo longitudinal seis meses após a primeira investigação sorológica constatou, através do antígeno SLA, que os índices de infecção por Leishmania se mantiveram relativamente constantes nas áreas periurbana e rural, registrando-se percentuais altos de conversão e reversão sorológica. Essa avaliação denota a dinâmica da infecção por Leishmania na população canina, contribuindo consequentemente para a manutenção da endemia e para a disseminação e urbanização da infecção humana e canina no Estado do RN. Quanto à expressão das subclasses de IgG nos animais reavaliados verificou-se que os percentuais de IgG2 anti-Leishmania continuaram maiores em relação à IgG1, porém, o número de cães que apresentou reversão dos títulos de IgG1 e IgG2 foi significativamente maior que
o número de cães que soroconverteu. Nesse sentido, sabe-se que os cães podem reverter os títulos de anticorpos para soronegatividade em períodos variáveis de tempo após a infecção (COURTENAY et al., 1994), como demonstrado também nos cães de Belém-PA em um estudo longitudinal, com intervalos de apenas 60 dias entre os exames sorológicos (QUINNELL et al., 1997); porém permanecem na maioria das vezes parasitologicamente positivos (MOREIRA, Jr. et al., 2004).
A presença de soroconversão demonstra que, tanto os cães de área periurbana como aqueles de área rural, vivem em ambientes expostos a uma estimulação antigênica contínua ao parasita. Assim os inquéritos sorológicos e a retirada dos animais soropositivos, por motivos geográficos, financeiros e operacionais, não conseguem acompanhar a dinâmica da infecção e, portanto, não representam um meio efetivo de diminuir a prevalência da doença canina e, consequentemente, humana (DANTAS-TORRES, 2006; WHO, 1999). Diante disto, a investigação e o desenvolvimento de estratégias que possam evitar a infecção e a propagação da doença na população canina e humana se caracterizam como necessidades prementes no âmbito da pesquisa científica e da saúde pública.
5.6. Identificação da(s) espécie(s) de Leishmania isolada(s) em cães soropositivos recolhidos no CCZ de Natal
Da população de 146 cães do CCZ arrolados no estudo, um subgrupo de 28 animais foram eutanasiados objetivando o isolamento e a identificação da espécie de Leishmania responsável pela infecção. Culturas isoladas do baço de 24 cães foram obtidas e tipificadas por isoenzimas, mostrando que L. i.
chagasi foi a espécie infectante nos cães oriundos de áreas de prevalência da infecção canina por Leishmania no município de Natal (Figura 13).
Figura 13: PCR-RFLP para identificação da espécie de Leishmania a partir de DNA proveniente de cultura de baço canino
No subgrupo dos 28 animais eutanasiados, 24 receberam um diagnóstico parasitológico positivo a partir da cultura de fragmentos de baço em meio Schneider. Destes, 100% foram confirmados sorologicamente através do ELISA utilizando o antígeno SLA e 83.3% foram confirmados pelo antígeno recombinante rK39, demonstrando a sensibilidade dos antígenos testados (Tabelas 23 e 24). Nos animais com resultados de cultura de Leishmania negativos observou-se 25% de especificidade para o antígeno SLA (Tabela 23) e 50% de especificidade para o antígeno rK39 (Tabela 24).
25 bp 100 bp 200 bp 400 bp 300 bp Coluna 1: Marcador (25bp)
Coluna 2: controle positivo genotipado IOC 3071 (L. chagasi humana)