2. PROSTAT KANSERİ TANISINA YÖNELİK ANTİ-PSMA TABANL
2.2 Bulgular ve Tartışmalar
2.2.5 Biyolojik tanıyıcı yüzeyin hazırlanması
Önceki bölümlerde anlatıldığı şekilde 75 W-10 dk oksijen plazma ile aşındırılan QTF yüzeyleri, 5 s süresince AL-SSA nanofiberlerle modifiye edilmiştir. Ardından AL- SSA nanofiberdeki amin gruplarının gluteraldehit ile aktifleştirilmeleri sağlanarak tanıyıcı yüzey antikor bağlanmasına uygun hale getirilmiştir. GA modifikasyonu öncesi ve 2 saat gluteraldehit aktifleştirmesi sonrasında AL-SSA nanofiberlerin SEM görüntüleri, Şekil 2.6’ da gösterilmektedir.
SEM görüntülerinden de anlaşılacağı üzere, 5 s süresince üretilen nanofiberler oldukça homojen olmasına rağmen, 2 saat süreyle yapılan gluteraldehit aktivasyon işlemi sonrasında fiberler fiber formdan jelsi yapıya dönüşmüştür. Nanofiberlerin morfolojik yapısı incelendiğinde fiberlere ait homojen dağılımının aldehit modifikasyonu sonrasında negatif yönde etkilendiği gözlemlenmiştir.
Fiberlerin ortalama yarıçaplarının hesaplanmasında ImageJ programı kullanılmış ve bu kapsamda 20 nanofiberin çap değeri ölçülerek bu değerlerin ortalaması hesaplanmıştır. Gluteraldehit modifikasyonu öncesinde fiberlerin ortalama çap değeri 260±33 nm olarak hesaplanmış, 2 saat gluteraldehit uygulanan örneklerde ise bu değer 411±114 nm’e yükselmiştir. Gluteraldehit uygulaması sonrasında çaptaki standart sapmanın bu seviyede artışı, homojenitenin bozulduğunun başka bir göstergesi olsa da frekans sonuçları da göz önünde bulundurulduğunda 1 saat gluteraldehit aktivasyonunun protein immobilizasyonu için yeterli olmaması nedeniyle, antikor immobilizasyonu öncesinde nanofiber yüzeylerinin 2 saat süresince GA aktifleştirilmesinin yapılmasına karar verilmiştir.
Biyolojik tanıyıcı tabaka hazırlığının ikinci aşamasında ise, 5 s birikim süresi kullanılarak nanofiber modifiye edilen QTF’ler hacimce %10 oranında PBS (pH:7,4) ile seyreltilen a-PSMA çözeltisine daldırılarak + 4 C°’de ve 18 saat süreyle antikor immobilizasyonu gerçekleştirilmiştir. Son olarak, 1% SSA ile 30 dakika etkileştirilen ayar çatallarının aktif olmayan aldehit uçlarının bloklanması gerçekleştirilerek spesifik olmayan etkileşimlerin azaltılması sağlanmıştır
Şekil 2.5 : Gluteraldehitle aktivasyon işlemi öncesi ve sonrasında AL-SSA modifiye QTF yüzeylerine ait taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüleri. Modifiye olmadan önceki AL-SSA nanofiber yapılı membran ait (a) X20.000 büyütme, (b) X1.000 büyütmeli SEM görüntüleri ve 2 saat GA modifiye örneğe ait (c) X20.000 büyütme, (d) X1.000 büyütmeli SEM görüntüleri.
Modifikasyonların etkinliğini kanıtlamak için yüzey hassas kimyasal analizler kapsamında FTIR-ATR analizi gerçekleştirilmiştir. FTIR-ATR analizi modifiye edilmemiş (QTF), nanofiber modifiye (AL-SSA) ve antikor modifiye AL-SSA (AL- SSA/a-PSMA) örneklerinin yüzeylerindeki fonksiyonel grupların tespitinde kullanılmış ve ilgili spektrumlar Şekil 2.7’ de verilmiştir. Yansıtma (transmitans) verileri incelendiğinde, QTF’teki en belirgin piklerin 3600 cm-1’deki serbest −OH ve
3500-2500 cm-1 üzeri geniş −OH bandı olduğu gözlemlenmiştir (Navarra vd. 2005). Nanofiber modifikasyonu sonrası AL-SSA örneğinde, −OH piklerinin intensitesi azalmış buna karşın 3300 cm-1 ve 1529 cm-1’deki −NH birincil aminin bükülme
vibrasyon pikleri oluşmuştur. AL-SSA/a-PSMA örneğinde ise, AL-SSA örneğindeki birincil amino gruplarına karşılık gelen pik şiddetlerinin azaldığı gözlemlenmiştir. Bu durum, amiloid forma denatüre edilen proteininin immobilize edilen proteine kıyasla birincil formları daha çok içermesi ile açıklanabilir ayrıca protein denatürasyonunun da antikor immobilizasyonunun da başarılı olduğunu göstermektedir. AL-SSA
(c)
(b) (a)
örneğinde diğer örneklerden farklı olarak 1648 cm-1’de gözlemlenen güçlü pik, amid veya amidin gruplarının −CN bükülmesinden kaynaklanmaktadır. AL-SSA örneğine antikor immobilizasyonu yapılması sonrasında bu karakteristik pikin de intensitesinin düştüğü gözlemlenmiştir.
Özetle, PSMA ölçümüne yönelik geliştirilen QTF immünosensorünün üretim basamakları şu şekilde sıralanabilir. Optimizasyon çalışmaları sonucunda elde edilen veriler ışığında QTF uçları, elektro-eğirme işlem parametreleri: 0,20 mL/s akış hızı, 10 cm iğne ucu-kollektör arası mesafe ve 12 kV voltajda, 5 s süresince nanofiberle modifiye edilmiştir [96]. Ardından 2 saat gluteraldehitle aktifleştirilen AL-SSA nanofiber modifiye uçlara sırasıyla antikor immobilizasyonu ve %1 SSA bloklanması işlemleri gerçekleştirilmiş ve bu şekilde biyolojik tanıyıcı tabaka hazırlanmıştır. PSMA antijeninin ölçümü aşamasında öncelikle pg seviyedeki PSMA antijeninin ölçümü yapılsa da sonuçlar anlamlı çıkmamıştır. Ardından 1 ng/mL ve 1000 ng/mL arası konsantrasyonlarda hazırlanan PSMA antijenleri ile etkileştirilen QTF uçlarında gerçekleşen frekans değişimleri incelendiğinde, lineer regresyon değeri en yüksek olan 5-100 ng/mL aralığı, immünosensörün lineer ölçüm aralığı (LDL) olarak belirlenmiştir (R2=0,967). Sistemin en düşük ölçüm limiti (LOD) Eşitlik 7 kullanılarak 33,4 ng/mL olarak hesaplanmıştır. Şekil 2.8’ de immünosensöre hedef antijeni PSMA’nın bağlanması sonucunca meydana gelen frekans kayma değerleri gösterilmektedir. Şekil 2.8’ de gösterildiği üzere LOD değeri oldukça küçük olsa da ölçümlerdeki standart sapma değerleri oldukça yüksektir. 100 ng/mL PSMA konsantrasyonun üzerindeki konsantrasyonlar için antijen ölçümü yapılamaması, sıvı ortamda nanofiberlerin ve dolayısıyla biyolojik tanıyıcı tabakanın yeterince stabil olmaması dolayısıyla da QTF yüzeylerinden ayrılmalarıyla ilişkilendirilmiştir.
2.2.6 Seçicilik testi
Seçicilik testi, biyosensörün oldukça çok sayıda protein içeren vücut sıvılarında kullanılabilirliğini test etmek açısından oldukça önemlidir. Bu doğrultuda, a-PSMA modifiye edilmiş QTF’ler 100 ng/mL konsantrasyonundaki kaveolin-1, interlökin ve PSA antijen çözeltileri ile 30 dakika süresince ayrı ayrı etkileştirilmiştir (Şekil 2.9). Elde edilen sonuçlar, a-PSMA tabanlı immünosensörün hedef olmayan proteinlere karşı afinitesinin düşük olduğunu göstermektedir. Sonuç olarak, antikor a-PSMA’nın hedef analite özgü yani antijenine seçici olduğu gösterilmiştir.
𝐿𝑂𝐷 =𝑘×𝑆𝐷
𝑚 ; 𝑘 = 3,3 (7)
Şekil 2.6 : FTIR-ATR spektrumu (a) QTF, (b) AL-SSA/a-PSMA, (c) AL-SSA.
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
AL-SSA
Dalga numarası (cm
-1)
Dalga numarası (cm
-1)
Dalga numarası (cm
-1)
AL-SSA/a-PSMA
QTF
(a) (b) (c)Şekil 2.7 : a-PSMA tabanlı prostat kanseri immünosensörünün hedef analiti PSMA proteinini bağlaması sonucu oluşan frekans değişimleri ve kalibrasyon eğrisi. Frekans değerleri ortalama±standart sapma (±SD) olarak verilmiştir (n=3).
Şekil 2.8 : İmmünosensörün hedef olan PSMA ve hedef olmayan interlökin, PSA ve kaveolin antijenleriyle etkileşimleri sonucu ölçülen ortalama frekans değişimleri (n=10). Frekans değerleri ortalama±standart sapma (±SD) olarak verilmiştir. (n=3).
0 20 40 60 80 100 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 f Lineer Fit Fr eka ns ( Hz) Konsantrasyon (ng/ml) Equation y = a + b*x Plot B Weight Instrumental Intercept -25,65465 ± 8,0980 Slope -0,81424 ± 0,10708
Residual Sum of Squares 1,22857
Pearson's r -0,98314 R-Square(COD) 0,96657 Adj. R-Square 0,94985 0 -10 -20 -30 -40 -50 -60 -70 -80 -90 -100 -110 -120 -130