Bitki doku kültürü teknikleri

2.7.3.5.1. Mikroçoğaltım

Günümüzde mikroçoğaltım temel olarak 5 aşamada ifade edilmektedir. Mikroçoğaltım sağlıklı, kuvvetli bir ana bitkiden bitki dokularının (eksplant) seçilmesi ile başlar (Murashige, 1974). Bitkinin herhangi bir kısmı (yaprak, apikal meristem, tomurcuk ve kök) eksplant olarak kullanılabilir. Mikroçoğaltımın aşamaları Tablo 2. 12’de kısaca tarif edilmiştir.

Tablo 2.12. Temel mikroçoğaltım aşamaları (Hussain ve ark., 2012)

Aşama Method

Başlangıç Aşaması Başlangıç bitkisinin seçimi

1.aşama Kültürün başlatılması

2.aşama Sürgün çoğaltılması yada hızlı somatik ambriyo formasyonu

Başlangıç Aşaması:

Bu aşama, mikroçoğaltımın ilk adımıdır ve kontrollü koşullar altında stok bitkilerinin seçimi ve yaklaşık 3 ay boyunca büyümesini içerir.

Hazırlık Aşaması:

Bu aşamada uygun kültür ortamının hazırlanması sağlanır. Uygun eksplantların seçilmesi önemlidir. En sık kullanılan eksplantlar organlar, sürgün uçları ve aksiller tomurcuklardır. Seçilen eksplant yüzey sterilizasyonuna tabi tutulur ve kullanılmadan önce yıkanır.

Sürgün Aşaması:

Bu aşamada, mikroçoğaltım tanımlanmış bir kültür ortamında gerçekleşir. Bu aşama ağırlıklı olarak sürgünlerin çoğalması veya eksplanttan hızlı embriyo oluşumunu içerir.

Köklendirme Aşaması:

Bu aşamada eksplantlar köklerin hızlı bir şekilde gelişimi için ortam içeriği farklı olan kültür kaplarına aktarılır. Bazen sürgünler kök geliştirmek için toprağa dikilebilir. Ancak sürgünlerin in vitro köklendirilmesi, aynı anda çok sayıda türün kullanımı sırasında tercih edilir.

Şartlandırma Aşaması:

Bu aşama, laboratuvar koşullarında üretilen bitkilerin toprağa aktarılmasını içerir. Bu aşamada, bir önceki aşamada elde edilen bitkilerin laboratuvar ortamından sera koşullarına aktarılması işlemi yapılır. Bazı bitki türleri için köklendirme aşaması atlanır ve köklü olmayan sürgünler saksılara veya uygun kompost karışıma ekilir.

2.7.3.5.1.1. Mikroçoğaltımı Etkileyen Faktörler

Başarılı bir in vitro klonal çoğaltım (mikroçoğaltım) için, çeşitli faktörlerin optimizasyonu gereklidir;

a) Bitkinin genotipi: Mikroçoğaltım için doğru genotipinin seçilmesi (tarama yoluyla) gereklidir. Çoğunlukla çimlenme ve dallanma kapasitesine sahip bitkiler, mikroçoğaltım için daha uygundur.

b) Eksplantların fizyolojik durumu: Genç bitkilerden alınan eksplantlar (bitki materyalleri) yaşlı bitkilerden alınan eksplantlara göre daha etkilidir. Çoğaltımı yapılacak

olan bitkinin gelişme aşaması ve mevsimsel etki hakkında bilgi edinilmesi gerekir. Bu eksplant seçiminde yarar sağlamaktadır.

c) Kültür ortamı: Standart bitki doku kültürü ortamı, I. aşama ve II. aşama sırasında mikroçoğaltım için uygun olmalıdır. Bununla birlikte, III. aşama için büyüme düzenleyicileri (oksinler ve sitokininler) ve mineral bileşimindeki değişiklikler gereklidir. Bu büyük oranda kültür türüne (meristem, tomurcuk, vb.) bağlıdır.

d) Kültür şartları:

Işık: Kültürlenen dokulardaki fotosentetik pigment, ışığı emer ve böylece mikroçoğaltımı etkiler. Işık kalitesinin, sürgünlerin in vitro büyümesini etkilediği bilinmektedir, örneğin tütün sürgünlerinde mavi ışık kaynaklı tomurcuk oluşumunu sağlar. Gün ışığındaki aydınlatma varyasyonları da mikroçoğaltımı etkiler. Genel olarak, 16 saatlik aydınlık ve 8 saatlik karanlık periyot uygulaması sürgün oluşumu için olumlu sonuçlar vermektedir.

Sıcaklık: Mikroçoğaltım kültürünün çoğunda optimum sıcaklık 25° C’dir. Bununla birlikte, bazı istisnalar vardır; Begonia X Cheimantha melez dokusu düşük sıcaklıkta (yaklaşık 18 °C) yetişmektedir.

Gaz fazının bileşimi: Kültür kaplarındaki gaz fazının oluşumu da mikroçoğaltımı etkiler. Hücrelerin büyümesi genelde etilen, O2, CO2 etanol ve asetaldehit ile sağlanır.

İn vitro köklenmeyi etkileyen faktörler: Mikroçoğalmayı etkileyen faktörlerin, özellikle de sürgün çoğalmasıyla ilgili genel bir tanımlaması yukarıda verilmiştir. Mikroçoğaltım sırasında in vitro köklenme için, düşük tuz konsantrasyonu olumlu sonuçlar vermektedir. Köklerin indüksiyonu, uygun oksin (NAA veya IBA) varlığı ile de desteklenir.

2.7.3.5.2. Somatik embriyogenezis ve organogenezis

İn vitro bitki rejenerasyon yöntemi olan somatik embriyogenezis, sürekli klonal çoğaltım için önemli biyoteknolojik araç olarak yaygın bir şekilde kullanılmaktadır (Park ve ark., 1998). Somatik embriyogenezis, somatik hücreler veya dokuların farklılaşmış embriyolara dönüştüğü bir süreçtir. Bu somatik embriyolar, zigotik embriyoların yaptığı gibi, fertilizasyon sürecine girmeden tüm bitkiyi oluşturabilir. Somatik embriyogenez direkt olarak eksplantlardan başlatılabilir veya indirekt olarak kallus adı verilen organize

Somatik embriyogenez yoluyla bitki rejenerasyonu, tohum, yaprak veya gövde segmentinden embriyojenik kültürlerin indüksiyonu ve embriyoların hızla çoğaltılmasıyla oluşur. Olgun embriyolar daha sonra çimlenme ve bitki gelişimi için kültürlenir ve en sonunda toprağa aktarılır.

Farklı familyalara ait çok sayıda ağaç ve süs bitkilerini içeren çoğu bitki türünde somatik embriyogenezis başarılı bir şekilde uygulanmaktadır. Birçok kaktüs türünde de somatik embriyogenezis gerçekleştirilmiştir (Torres-Muñoz ve Rodriguez-Garay, 1996). Kültür hücrelerinde somatik embriyoların indüksiyonunu ve gelişimini etkileyen çeşitli faktörler vardır. Kültür ortamında somatik embriyojenez için alınan dokular sıvı ortamda kültürlendiğinde yeterince yüksek bitki rejenerasyonu gösterdiği yüksek verimli bir protokol bildirilmiştir (Jayasankar ve ark., 1999). Bitki büyüme düzenleyicileri, somatik embriyoların yenilenmesi ve proliferasyonunda önemli bir rol oynamaktadır. Birçok bitkide en yüksek embriyonik kallus verimliliği, bitki büyüme düzenleyicilerinin tek başına veya kombinasyon halinde kullanıldığı ortamda gerçekleştirilmiştir (Li ve ark., 2002). Bu embriyonik kallusun, yalnızca absisik asit (ABA) içeren ortamda yetiştirildiğinde somatik embriyoların yüksek çimlenme oranına sahip olduğunu gösterilmiştir. Somatik embriyojenez, yalnızca bitkilerin büyük çapta çoğaltımı için bir rejenerasyon türü değil aynı zamanda genetik manipülasyon için değerli bir araç olarak da kabul edilir. Bu süreç, ayrıca çeşitli streslere dirençli bitkileri (Bouquet ve Torregrosa, 2003) geliştirmek ve genleri genetik transformasyonla tanıtmak için kullanılabilir (Maynard ve ark.,1998).

Organogenez: Direkt olarak meristemden veya indirekt olarak ayrışmamış hücre kütlelerinden (kallus) oluşan bitki organlarının, yani köklerin, filizlerin ve yaprakların üretimini ifade eder. Organogenez yoluyla bitki rejenerasyonu, besin ortamında bitki büyüme hormonlarının konsantrasyonunu değiştirerek kallus üretimini ve adventif meristemlerin organlara farklılaşmasını içerir. Skok ve Muller tütün bitkisinde, yüksek sitokininin/oksin oranının sürgün rejenerasyonunu, yüksek oksin/sitokinin oranının kök rejenerasyonunu uyardığını gösteren ilk kişidir (Skoog ve Miller, 1957).

a) Direkt Organogenez: Yapraklardan, saplardan, köklerden ve çiçek petallerinden alınan dokular, doğrudan bitki organlarını üretmek üzere kültüre alınabilir. Direkt organogenezde, doku, bir kallus veya süspansiyon hücre kültürü aşamasına girmeden morfogenezi gerçekleştirir. Direkt adventif organ oluşumu terimi direkt organogenez için de kullanılır.

Doğrudan kök, yaprak ve çeşitli organlar üzerindeki adventif tomurcuklanma oluşumunun indüksiyonu bitki çoğaltımı için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu yaklaşım özellikle otsu türler için yararlıdır. Kültür sisteminde uygun organogenez için ekzojen ek büyüme düzenleyicileri (Oksin ve sitokinin) gereklidir. Büyümeyi teşvik eden maddenin konsantrasyonu büyüme koşullarının yanı sıra eksplantın yaşı ve doğasına da bağlıdır.

b) İndirekt Organogenez: Organogenez kallus veya süspansiyon hücre kültürü oluşumu yoluyla gerçekleştiğinde indirekt organogenez olarak kabul edilir. Kallus büyümesi, sonraki organogenezise yönelik birçok eksplanttan (yapraklar, kökler, kotiledonlar, saplar, çiçek yaprakları vb.) oluşturulabilir.

Organogenez için eksplantlar, mitotik olarak olgunlaşmamış dokular olmalıdır. Genellikle, eksplant ne kadar büyük olursa, canlı kallus/hücre süspansiyon kültürleri elde etme şansı da o kadar iyi olur. Etkili bir indirekt organogenez için meristematik dokuları (sürgün ucu, yaprak ve yaprak sapı) seçmek daha avantajlıdır. Çünkü büyüme oranı ve hayatta kalma oranı çok daha yüksektir.

İndirekt organogenez için, kültürler sıvı ortamda veya katı ortamda yetiştirilebilir. Organogenezde kullanılan çok sayıda kültür ortamı (MS, B5 White vs.) vardır. Ortamdaki büyüme düzenleyicilerinin konsantrasyonu organogenez için kritik öneme sahiptir.

 Oksinlerin ve sitokininlerin konsantrasyonlarını değiştirerek, in vitro organogenezasyon manipüle edilebilir:

 Düşük oksin ve düşük sitokinin konsantrasyonu kallus oluşumunu indükleyecektir.

 Düşük oksin ve yüksek sitokinin konsantrasyonu, indirekt organogenezisi teşvik eder.

 Yüksek oksin ve düşük sitokinin konsantrasyonu kök oluşumuna neden olur (Hussain ve ark., 2012).