BİYOLOJİK ETKİ ÇALIŞMALARI

Sentezini yaptığımız bileşiklerin antikonvülsan aktivite çalışmaları, Deney Hayvanları Etik Kurul kararı (23.02.2010 tarih ve 2010/13-7 numaralı) doğrultusunda (Ek 1) Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Kimya Anabilim Dalı’nda yapılmıştır.

Bileşiklerin antibakteriyel ve antifungal aktiviteleri, Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Laboratuarı’nda tayin edilmiştir.

3.2.1. Antikonvülsan Aktivite Taraması

Sentezi yapılan bileşiklerin antikonvülsan aktivitelerinin incelenmesinde, 1975 yılında National Institute of Neurological Disordes and Stroke (NINDS) tarafından geliştirilen, Antiepileptic Drug Development (ADD) programı Tarama I testleri uygulanmıştır.

Antiepileptik potansiyele sahip tüm bileşiklere uygulanan Tarama I testlerinde, maksimal elektroşok (MES), subkütan metrazol (scMet) ve rotarod nörotoksisite testleri kullanılmaktadır. Tarama I testleri, farelerde geniş bir doz aralığında (30, 100, 300 mg/kg) antikonvülsan aktivitenin taranmasını ve bu sayede antikonvülsan aktiviteye sahip olmayan bileşikler için, zaman ve maliyet kaybını önleyerek, antikonvülsan aktiviteye sahip bileşiklerin seçilmesine imkan tanımaktadır. Minimal nörolojik bozukluğun tespiti için de rotarod nörotoksisite testi yapılır.

Test sonucunda 30, 100 ve 300 mg/kg dozlarda MES ve/veya scMet testinde aktif, rotarod nörotoksisite testinde olumlu bulunan bileşikler daha ileri farmakolojik çalışmalar yapılmak üzere Tarama II’ye alınmaktadır (198-200).

Çalışmamızda sentezi yapılan bileşiklere, bu program çerçevesinde, Tarama I testleri olan MES, scMet ve rotarod nörotoksisite testi uygulanmıştır.

Materyal

Antikonvülsan aktivitenin tayininde Stimülatör (Grass S88, Astro-Med. Inc. Grass Instrument Division, W. Warwick, RI, USA), constant current unit (Grass CCU1A, Grass Medical Instrument, Quincy, Mass., USA), korneal elektrot, rotarot, PEG (polietilen glikol) 400 (J.B. Baker), metrazol (Aldrich) ve Hacettepe Üniversitesi Deney Hayvanları Laboratuvarından temin edilen 20 ± 2 g ağırlığında erkek fareler (Wister albino) toplamda 360 adet kullanılmıştır.

Yöntem

Tarama I testinde 30, 100 ve 300 mg bileşik tartılır; üzerine 1 ml PEG 400 ilave edilir. Böylece bileşiklerin PEG 400’deki % 0.3, 1 ve 3’lük (a/h) homojen süspansiyonları hazırlanmış olur. Bu süspansiyonlardan 30, 100 ve 300 mg/kg’lık dozlara karşılık gelen miktarlar i.p. yolla farelere verilir (199, 200).

Bir bileşik için her doz seviyesinde dört fare olmak üzere toplam oniki fare kullanılmıştır. Kullanılan dört farenin ikisine 0.5 saat, diğer ikisine ise 4 saat sonunda MES ve scMet ile indüklenmiş nöbet testleri uygulanmıştır.

Her doz için MES ve scMet ile indüklenmiş nöbet testleri uygulanan dört farenin hepsi 0.5 saat, ikisi de 4 saat sonunda rotarod toksisite testine tabi tutulmuştur (Şekil 3.1).

Maksimal Elektroşok (MES) Nöbet Testi

Farelerin her iki gözüne % 0.9’luk sodyum klorür çözeltisinin damlatılmasından sonra, korneal elektrot ile 0.2 saniye süreyle 60 Hz frekansta ve 50 mA’lik alternatif akım uygulanmıştır (199, 201). Farelerde toplam 22 saniye kadar süren tipik nöbetler maksimal nöbetlerdir. Fareler akım verilmesini takiben arka bacakların vücut düzlemiyle yaptığı açının 90°’yi geçmemesi nöbetten korunma olarak kabul edilmiştir (202).

Subkütan Metrazol (scMet) ile İndüklenmiş Nöbet Testi

Farelere bileşiklerin 30, 100 ve 300 mg/kg’lık dozlarda i.p. olarak uygulanmasını takiben, test edilen hayvanlarda en az 5 sn süren klonik konvulsiyonların oluşmasına neden olan metrazol % 0.5’lik çözelti halinde 30 dakika ve 4 saat sonra subkütan olarak farelerin orta karın bölgesine enjeksiyonla verilmiştir. Metrazol enjeksiyonunu takiben 30 dakika süreyle fareler izlenmiştir. Bu süre içinde 5 sn’den uzun süren klonik kasılmaların gözlenmemesi, bileşiğin metrazolün nöbet eşik etkisinden koruduğunu göstermiştir (202).

Rotarod Nörotoksisite Testi

Rotarod testi farelerde bileşiğin indüklediği minimal nörolojik bozukluğun tespiti için yapılmıştır. Bu testte 2.54 cm çapında ve 6 devir/dakika hızla dönen tahta bir disk kullanılmıştır. Madde uygulanmamış fareler bu dönen diske yerleştirildiklerinde uzun süre dengelerini kaybetmeden yürürler. Nörolojik bozukluk hayvanın bu disk üzerinde dengesini bir dakika kadar koruma yeteneğinden yoksun oluşu ile belirlenmiştir (199).

Nörotoksisite testi her fareye nöbet testi uygulamasından hemen önce yapılmıştır.

Sonuçların Değerlendirilmesi

Test edilen bileşiklerin antikonvülsan etkileri, MES Nöbet Testi, scMet Nöbet Testi ve Nörotoksisite (Rotarod Test) sonuçları; 0/1 (ilgili doz seviyesinde etkili değil) ve 1/1 (ilgili doz seviyesinde etkili) olarak ifade edilir.

3.2.2. Antimikrobiyal Aktivite Tayini Materyal

Mikrotitrasyon plağı, Mc Farland 0.5 çözeltisi, DMSO (dimetilsülfoksit) (Merck), siprofloksasin (M. Nevzat), flukonazol (Pfizer Inc.), Mueller-Hinton broth (BBL Microbiology Systems), RPMI-1640 besiyeri (ICN-Flow), MOPS [3-(N-morfolino)propanosülfonik asit] tamponu (ICN-Flow), Mueller-Hinton agar (BBL Microbiology Systems) ve Saboraud dekstroz agar (Merck) kullanılmıştır.

Sentezi yapılan bileşiklerin Staphyloccus aureus ATCC 29213, Enteroccocus

faecalis ATCC 29212 gibi Gram (+) ve Escherichia coli ATCC 25922,

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 gibi Gram (-) bakterilere, Candida albicans ATCC 90018, Candida krusei ATCC 6258 ve Candida parapsilosis ATCC 22019 gibi maya benzeri funguslara karşı, antibakteriyel ve antifungal aktiviteleri incelenmiştir.

Yöntem

Sentezi yapılan bileşiklerin antimikrobiyal etkilerinin incelenmesinde “National Committee for Clinical Laboratory Standarts" (NCCLS) tarafından önerilen mikrodilüsyon yöntemi kullanılmış ve bileşiklerin MİK değerleri tayin edilmiştir (203, 204).

Antibakteriyel ve antifungal etkileri araştırılacak bütün bileşiklerin stok çözeltileri DMSO içinde hazırlanmıştır. Bunun için bileşikleri çözecek minimum miktarda DMSO kullanılmış, geri kalan hacim uygun besiyerleri ile tamamlanmıştır. Antibakteriyel ve antifungal standart olarak kullanılan siprofloksasin ve flukonazolun steril distile suda stok çözeltileri hazırlanmıştır. Test edilen diğer bileşiklerin daha düşük konsantrasyonundaki dilüsyonları için Mueller-Hinton broth (MHB), Candida suşları için ise L-glutamin içeren sodyum bikarbonatsız RPMI-1640 besiyerinde, son konsantrasyonların 4 katı olacak şekilde yapılmıştır. Tampon çözelti olarak MOPS tampon kullanılarak, RPMI-1640 besiyeri pH 7’ye ayarlanmıştır.

Standart Suşların Ayarlanması

Bakteri suşları Mueller-Hinton agarda (MHA) 35 °C’de 24 saat inkübe edildikten sonra 4-5 ml steril serum fizyolojik içinde 0.5 Mc Farland çözeltisine eşdeğer bulanıklığa ayarlanmıştır (1.5x10⁸ cfu/ml). Buradan son bakteri konsantrasyonu 5x10⁵ cfu/ml olacak şekilde steril serum fizyolojik çözeltisi kullanılarak dilüe edilmişir. Candida suşları ise Saboraud dekstroz agarda 35 °C’de 24 saat inkübe edilmiş, 4-5 koloniden örnek alınarak steril serum fizyolojik ile yine 0.5 Mc Farland çözeltisinin bulanıklığı ayarlanmıştır. Daha sonra RPMI-1640 besiyerinde son inokulum konsantrasyonu 0.5-2.5x103 cfu/ml olacak şekilde ileri dilüsyonları yapılmıştır.

Mikrodilüsyon Yöntemi

Çalışmada 96 kuyu içeren U tabanlı steril mikrotitrasyon plaklar kullanılmıştır. Antibakteriyel aktivite çalışmalarında steril pastör pipeti ile her sıranın ilk 11 çukuruna 50’şer mikrolitre MHB,antifungal aktivite çalışmalarında ise RPMI-1640 besiyeri eklenmiştir. Her plağın iki çukuru sadece besiyeri kontrolü üreme (besiyeri ve mikroorganizma) kontrolünü içerecek şekilde hazırlanmıştır. Her sıranın ilk çukurlarına, daha önce belli konsantrasyonda hazırlanmış olan bakteriler için siprofloksasin ve Candida suşları için flukonazol stok çözeltilerinden 50’şer mikrolitre konulmuştur (64-0.00625 µg/ml).Diğer çukurlara ise ilaç çözeltileri, sekiz kanallı mikropipet ile ikişer kat artan dilüsyonlarda konulmuştur (512-0.00625 µg/ml). İlaç dilüsyonları içeren bütün çukurlara ve üreme kontrolü çukuruna 50’şer mikrolitre daha önce hazırlanmış olan bakteri ve mantar süspansiyonu içeren tüplerden damlatılmıştır. Mikroplaklar hafifçe çalkalanarak karışmaları sağlandıktan sonra, bakteriler için 35 °C’de 24 saat, Candida suşları için ise 35 °C’de 48 saat inkübe edilmiştir.

Sonuçların değerlendirilmesinde bakteriler için, plaklar çalkalandıktan sonra gözle görülür bulanıklığın olmadığı en son çukurdaki dilüsyon, o bileşiğin MİK değeri olarak belirlenmiştir. Flukonazol için ise üreme kontrolünün bulanıklığı ile karşılaştırma yapılarak, bu bulanıklığın % 80’inden az veya buna eşit bulanıklık gösteren ilk konsantrasyon MİK değeri olarak belirlenmiştir.

4. BULGULAR